黃昭帥，林武，陳肖鳴

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 小兒外科，浙江 溫州 325015）

小鼠和人體中的自發(fā)熒光具有普遍性[1-2]。在觀察特定組織的分布時，自發(fā)熒光可能會對目的熒光造成影響，此時需要消除自發(fā)熒光，去除干擾免疫染色的背景，但研究也發(fā)現(xiàn)，自發(fā)熒光在組織的識別鑒定以及新的標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用中發(fā)揮一定作用[3-4]，因此，本研究觀察小鼠臟器組織中的自發(fā)熒光狀況，以及利用硫酸銅溶液去除自發(fā)熒光的效果，探索可用于觀察注射到小鼠體內(nèi)的目的熒光的適宜臟器。

1 材料和方法

1.1 試劑 硫酸銅購于美國Fisher Scientific公司；醋酸銨購于美國Sigma公司；DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、0.25%胰酶乙二胺四乙酸（EDTA）購于美國Gibco公司；雙抗（100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素）購于美國Invitrogen公司。

硫酸銅溶液配置：將1.927 g醋酸銨加入超純水，最后定容到50 mL，制成10×的0.5 mol/L儲備液。將7.9805 g硫酸銅加入到50 mL超純水中，制備1 000×的1 mol/L儲備溶液。在40 mL超純水中加入5 mL 10×的醋酸銨儲備液，再加入50 μL 1 000×的硫酸銅儲備液，將pH值調(diào)節(jié)成5，最后定容到50 mL硫酸銅醋酸銨液體（1 mmol/L硫酸銅、50 mmol/L醋酸銨）。

1.2 細(xì)胞和動物 大鼠腦膠質(zhì)瘤（RG2）細(xì)胞系由美國佛羅里達州立大學(xué)任藝教授惠贈。

4～6周齡SPF級C57/BL6小鼠8只，雌性，體質(zhì)量18～22 g，購于美國Jackson Laboratory，并在特定無病原體的動物設(shè)施中飼養(yǎng)。動物實驗經(jīng)美國佛羅里達州立大學(xué)實驗動物保護和使用組委會同意。

1.3 細(xì)胞實驗

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)：凍存的細(xì)胞系RG2從液氮罐中取出后，迅速于37 ℃水浴至融化，離心后棄上清，于配制好的含5% FBS、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)液中輕輕吹打均勻，置于5% CO2，37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.2 細(xì)胞分組和處理：細(xì)胞系RG2經(jīng)適應(yīng)性培養(yǎng)（傳代4次）后，傳代分成對照組和處理組。將2組細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中，等細(xì)胞成熟貼壁后，使用磷酸鹽緩沖液洗去培養(yǎng)液，并用4%多聚甲醛固定。處理組：使用上述配置的硫酸銅溶液10 min，經(jīng)蒸餾水潤洗后，熒光膠封片；對照組：未經(jīng)硫酸銅處理，直接熒光膠封片。

1.4 動物實驗

1.4.1 小鼠分組和處理：小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分為正常組和尾靜脈注射組，每組4只。尾靜脈注射組：收集細(xì)胞系RG2，將細(xì)胞重懸于其基礎(chǔ)培養(yǎng)基，濃度調(diào)節(jié)成106/mL，放于4 ℃冰盒中保存，經(jīng)尾靜脈注射100 μL細(xì)胞懸液入小鼠體內(nèi)，3 d后處死小鼠，經(jīng)心臟灌注后取下小鼠肺、肝臟以及脾臟。正常組：直接經(jīng)心臟灌注后取下小鼠肺、肝臟以及脾臟。將收集好的小鼠臟器存放于-80 ℃冰箱保存待冰凍切片。

1.4.2 冰凍切片：將切好的正常組和尾靜脈注射組小鼠臟器冰凍切片貼片放在室溫30 min，使用PBS溶液潤洗3次，每次5 min，再使用蒸餾水清潔1次，用配置好的硫酸銅醋酸銨混合液處理10 min，經(jīng)蒸餾水潤洗后，使用1∶1 000 Hoechst（溶解于1%PBS溶液中），孵育玻片10 min，顯微鏡觀察核染色效果，使用PBS溶液清洗，熒光膠封片。

1.5 熒光信號觀察 用Nikon倒置熒光顯微鏡拍照，使用配套NIS軟件對小鼠臟器進行隨機拍照（每一臟器切片獲取15～20張×200的圖片，重復(fù)3次，共得到45～60張圖片），觀察臟器中是否存在熒光信號。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞熒光分析 對照組的細(xì)胞熒光強度比處理組強，見圖1。

圖1 RG2細(xì)胞經(jīng)過硫酸銅處理前后熒光強度變化（×200）

2.2 小鼠臟器熒光觀察

2.2.1 脾臟：正常組小鼠脾臟冰凍切片在硫酸銅醋酸銨溶液處理前，可見大量綠色熒光背景（見圖2A-B）；硫酸銅處理后綠色熒光背景明顯減弱，但是仍然有其他熒光物質(zhì)（見圖2C-D）。

2.2.2 肺和肝臟：正常組小鼠肺和肝臟熒光背景很弱（見圖3A、C），尾靜脈注射組小鼠肺和肝臟可以清晰地分辨熒光細(xì)胞（見圖3B、D）。

3 討論

圖2 硫酸銅溶液處理前后脾臟的熒光背景變化（×200）

圖3 小鼠肝臟、肺組織內(nèi)RG2熒光細(xì)胞觀察

嚙齒類動物和人體組織（比如神經(jīng)系統(tǒng)、胃腸、乳房[5]）含有大量的自發(fā)熒光信號。許多內(nèi)生的熒光基團已被鑒定，例如芳香族氨基酸、細(xì)胞角蛋白、膠原蛋白/彈性蛋白、NAD（P）H、黃素、脂肪酸、維生素A、卟啉和脂褐素，這些分布在細(xì)胞內(nèi)外的內(nèi)在熒光信號可以根據(jù)它們的熒光信號范圍、分布和形態(tài)進行區(qū)分和鑒別，因此可以在疾病診斷、疾病恢復(fù)程度的判定等方面發(fā)揮作用。比如細(xì)胞內(nèi)存在多種內(nèi)源性熒光團可以揭示新陳代謝的重要過程[6-7]，腫瘤組織的代謝方式改變引起煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）與黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）的比例變化[8]，這兩種熒光變化可以作為鑒別腫瘤組織的指標(biāo)[9]。另外在外科手術(shù)中，甲狀旁腺的組織鑒別常常困擾外科醫(yī)師，運用甲狀旁腺的自身熒光特性可有助于手術(shù)切除范圍的界定[10-13]。盡管自發(fā)熒光有上述作用，但是在觀察目的熒光時需要消除自發(fā)熒光的影響，主要方法包括蘇丹黑B和硫酸銅。研究表明蘇丹黑在小鼠的腎臟和人體的腦、胰腺中能有效消除自發(fā)熒光[4，14-15]；硫酸銅對組織中的紅細(xì)胞的熒光信號淬滅也非常有效[16]，銅離子可以接受來自脂褐素中的電子，從而逆轉(zhuǎn)熒光信號的釋放。短效的硫酸銅溶液處理能夠快速有效地消除背景并且確保目的信號的保存[17]。

本研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞體外實驗中熒光細(xì)胞（RG2）信號可被削弱；在動物試驗中，C57/BL6小鼠3個臟器中，肺和肝臟中幾乎無明顯自發(fā)熒光，而小鼠脾臟中的自發(fā)熒光最為突出。自發(fā)熒光差別的主要原因可能與殘留的紅細(xì)胞相關(guān)：經(jīng)過心臟灌注后，肝臟、肺臟能夠迅速排除血液，而脾臟特異的血管分布、內(nèi)在結(jié)構(gòu)使紅細(xì)胞殘留，因而造成脾臟熒光背景的特殊性；脾臟也是人體最大的免疫器官，含有大量的免疫細(xì)胞包括巨噬細(xì)胞等，這些免疫細(xì)胞也參與脾臟自發(fā)熒光背景的形成。在本研究中，通過硫酸銅的處理，脾臟中仍有其他的熒光信號不能被硫酸銅所消除，考慮該熒光來源為某些內(nèi)在巨噬細(xì)胞及其他類型細(xì)胞，研究也發(fā)現(xiàn)，如果心臟灌注后，肺和肝臟去除血液效果較差，可考慮硫酸銅溶液處理。因此本研究認(rèn)為通過有效的心臟灌注并且以肺臟或肝臟為觀察器官可達到觀察外源信號的優(yōu)良效果。