丁萬隆，王蓉，郝單麗，張曉云，李勇*

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院 中藥研究所，北京 100700)

人參黑斑病由人參鏈格孢AlternariapanaxWhetz引起，屬該菌半知菌亞門，絲孢綱，絲孢目，鏈格孢屬真菌[1]。人參灰霉病病原為葡萄孢菌Botrytiscinera Pers.ex Fr.，屬半知菌亞門，絲孢綱，絲孢目，暗叢梗孢科，葡萄孢屬[2]。兩種病害是人參、西洋參生產(chǎn)上主要的葉部病害，主要為害人參葉片，常造成人參葉片大面積早期脫落或干枯，嚴(yán)重影響人參生長(zhǎng)后期干物質(zhì)積累，對(duì)人參產(chǎn)量影響較大[3]。另外，兩種病害還可侵染人參莖稈、花梗和果實(shí)，造成參籽減產(chǎn)[4]。

目前，對(duì)人參黑斑病、灰霉病等真菌性病害的防治，主要依賴農(nóng)業(yè)措施和化學(xué)農(nóng)藥[5-6]。由于單一農(nóng)藥的防治效果并不理想，多種農(nóng)藥長(zhǎng)期使用不僅加大了病原微生物抗藥性產(chǎn)生的潛在風(fēng)險(xiǎn)，還嚴(yán)重破壞了大氣、水源、土壤等生態(tài)環(huán)境因子以及賴以生存的生物以及微生物系統(tǒng)平衡[2，7]。另外，中藥材中殘留的化學(xué)農(nóng)藥對(duì)用藥安全也構(gòu)成極大的安全隱患[8]。

通過綠色防控手段減少化學(xué)農(nóng)藥使用，是中藥材農(nóng)殘超標(biāo)問題的關(guān)鍵。木霉菌和芽孢桿菌是生防微生物的重要組成部分，其在植物病害綠色防控過程中發(fā)揮重要作用[9]。目前，國(guó)內(nèi)市場(chǎng)微生物菌劑產(chǎn)品較多，但是其使用范圍僅局限于農(nóng)作物及設(shè)施蔬菜等，是否適用于中藥材病害防治需要研究后確認(rèn)。為此，本研究直接從微生物菌劑中分離菌株，以人參黑斑菌和人參灰霉菌為病原靶標(biāo)，通過對(duì)峙培養(yǎng)評(píng)價(jià)不同微生物菌劑中分離菌株的抑菌效果，從而間接評(píng)價(jià)上述菌劑產(chǎn)品用于人參病害防治的可行性，為人參病害綠色防控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌株：人參黑斑菌AlternariapanaxWhetz和人參灰霉菌BotrytiscinereaPres.ex Fr.由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所植保室保存。

生防菌株：供試生防菌劑共計(jì)12種，包括：枯草芽孢桿菌、蠟質(zhì)芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌和多粘芽孢桿菌可濕性粉劑7種；哈茨木霉、綠色木霉等木霉菌制劑5種。具體信息詳見表1。

1.2 菌株分離、純化

將木霉菌劑和芽孢桿菌制劑根據(jù)包裝濃度稀釋成1×106cfu·mL-1菌懸液。木霉菌用移液器取50 μL于PDA平板，涂布器均勻涂布整個(gè)平板，25 ℃恒溫倒置培養(yǎng)5 d，從菌落邊緣挑取菌絲于PDA平板上純化培養(yǎng)。芽孢桿菌用接種環(huán)蘸取適量，在LB培養(yǎng)基上劃線，30 ℃恒溫倒置培養(yǎng)12～24 h，挑取單菌落，純化培養(yǎng)。每種菌劑3次重復(fù)。

1.3 抑菌活性評(píng)價(jià)

將木霉菌、人參黑斑菌和人參灰霉菌分別接種到PDA平板上，25 ℃恒溫倒置培養(yǎng)5 d。用打孔器制成Φ 5 mm菌餅，分別將木霉菌和病菌對(duì)稱接種于PDA平板兩端，菌餅相距5 cm。以PDA培養(yǎng)基單獨(dú)接種人參致病菌作為空白對(duì)照。

將純化的芽孢桿菌劃線接種到LB平板，30 ℃恒溫倒置培養(yǎng)1 d。將人參致病菌接種于PDA平板一側(cè)，將活化的芽孢桿菌接種到平板的另一側(cè)，二者相距5 cm。以PDA培養(yǎng)基單獨(dú)接種人參致病菌作為空白對(duì)照。

將接種后的培養(yǎng)基置于25 ℃恒溫倒置培養(yǎng)7～10 d后，記錄人參致病菌菌落生長(zhǎng)情況，根據(jù)病菌統(tǒng)計(jì)結(jié)果計(jì)算抑菌率。每種處理3次重復(fù)。

(1)

1.4 數(shù)據(jù)處理

Excel 2007軟件用于原始數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析及繪圖。

表1 供試生物殺菌劑相關(guān)信息

2 結(jié)果與分析

2.1 生防菌株的分離純化

微生物菌劑對(duì)溫度、濕度、光照、儲(chǔ)藏時(shí)間等因素敏感，流通、儲(chǔ)存等環(huán)節(jié)操作不當(dāng)極易造成菌劑失活。研究發(fā)現(xiàn)，供試5種木霉制劑中，僅有哈茨木霉制劑(11#)中分離獲得活體菌株，木霉三種劑型(8#～10#)和綠色木霉可濕性粉劑(12#)均未分離到活體菌株。相對(duì)而言，芽孢桿菌類殺菌劑質(zhì)量相對(duì)穩(wěn)定，7種芽孢桿菌制劑均分離到活體菌株。但不同劑型之間差別明顯，可濕性粉劑分離到的活菌數(shù)量明顯高于微囊粒劑和水劑(表2)。

表2 12種微生物殺菌劑中活菌株的分離情況

注：“+++”表示活菌分離量大；“++”表示活菌分離量較大；“+”表示活菌分離量?。弧啊北硎疚捶蛛x到活菌。

2.2 分離菌株對(duì)人參黑斑菌的抑菌活性

人參黑斑菌(對(duì)照組)接種后生長(zhǎng)迅速，第3 d與木霉處理組形成顯著差異，第5 d與芽孢桿菌處理組形成顯著差異。與芽孢桿菌對(duì)峙培養(yǎng)過程中，自第5 d開始，人參黑斑菌與芽孢桿菌之間形成明顯的抑菌帶，病菌生長(zhǎng)基本停滯。與哈茨木霉對(duì)峙培養(yǎng)過程中，木霉生長(zhǎng)迅速，第3 d就將人參黑斑菌包圍，病菌生長(zhǎng)明顯減緩；第5 d后人參黑斑菌生長(zhǎng)空間進(jìn)一步被哈茨木霉壓縮，到第7 d能觀察到哈茨木霉菌絲已經(jīng)覆蓋人參黑斑菌，病菌生長(zhǎng)趨于停滯(圖1)。

試驗(yàn)結(jié)果表明，哈茨木霉生長(zhǎng)迅速，對(duì)峙過程中對(duì)人參黑斑菌的抑菌作用顯著，抑菌率達(dá)到65.18%；芽孢桿菌沒有真菌發(fā)達(dá)的菌絲體結(jié)構(gòu)，無法快速生長(zhǎng)，對(duì)人參黑斑菌的抑菌效果不如木霉菌顯著，且不同菌株間的抑菌作用差異不顯著，抑菌率僅為27.21%～33.04%。

編號(hào) 菌劑名稱 病菌半徑/mm抑菌率(%)1#枯草芽孢桿菌32.3±0.58 c30.232#枯草芽孢桿菌32.7±1.33 c29.373#枯草芽孢桿菌32.3±1.53 c30.234#蠟質(zhì)芽孢桿菌31.0±1.00 c33.045#解淀粉芽孢桿菌31.0±1.00 c33.046#堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌33.7±1.17 c27.217#多粘類芽孢桿菌33.7±1.52 c27.2111#哈茨木霉14.0±1.00 b65.18CK—46.3±0.56 a—

注：表中不同英文字母表示在P<0.05水平存在顯著差異。

2.3 分離菌株對(duì)人參灰霉菌的抑菌活性

人參灰霉菌(對(duì)照組)接種后生長(zhǎng)迅速，第3 d時(shí)與木霉及芽孢桿菌(2#菌株外)處理組形成顯著差異。與芽孢桿菌對(duì)峙培養(yǎng)過程中，人參灰霉菌病菌自第3 d生長(zhǎng)速度趨緩，第5 d時(shí)與對(duì)照組形成顯著差異，第7 d后病菌生長(zhǎng)基本停滯，此時(shí)能觀察到明顯的抑菌帶。芽孢桿菌2#菌株無抑菌帶生成，病菌菌絲能越過2#菌株繼續(xù)生長(zhǎng)。與哈茨木霉對(duì)峙培養(yǎng)過程中，木霉生長(zhǎng)迅速，第3 d將人參灰霉菌完全包圍，此后人參灰霉菌菌落逐漸減小，到第7 d能觀察到哈茨木霉菌絲已經(jīng)覆蓋人參灰霉菌，病菌生長(zhǎng)趨于停滯(圖2)。

圖2 生防菌株與人參灰霉菌對(duì)峙培養(yǎng)的生長(zhǎng)情況

抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明，哈茨木霉對(duì)人參灰霉菌的抑菌作用顯著，抑菌率76.82%；供試芽孢桿菌菌株對(duì)人參灰霉菌的抑菌效果存在較大差異，其中3#、4#、7#菌株的抑菌效果較好，抑菌率25.17%～29.40%；1#、5#、6#菌株的抑菌效果較差，抑菌率16.74%～20.32%；2#菌株的抑菌效果最差，抑菌率僅有10.74%。

表4 生防菌株對(duì)人參灰霉菌的抑菌效果

注：表中不同英文字母表示在P<0.05水平存在顯著差異。

3 討論

病害防治一直是困擾人參產(chǎn)業(yè)發(fā)展的棘手問題。人參病害防治過程中農(nóng)藥濫用，導(dǎo)致農(nóng)藥殘留問題突出[10-11]。加快病害防治技術(shù)革新，利用環(huán)境友好的微生物菌劑實(shí)現(xiàn)人參病害綠色防控，是解決人參等中藥材農(nóng)殘超標(biāo)問題的關(guān)鍵。目前，盡管枯草芽孢桿菌和哈茨木霉在人參病害防治過程中已取得合法登記，但市場(chǎng)上同類微生物菌劑標(biāo)注的使用范圍大多局限于農(nóng)作物或設(shè)施蔬菜，其是否對(duì)人參病害有確切防效缺乏科學(xué)依據(jù)。為此，本研究以人參黑斑菌和人參灰霉菌為靶標(biāo)，隨機(jī)從市場(chǎng)上選取了12種不同劑型木霉和芽孢桿菌微生物菌劑產(chǎn)品，通過活體菌株分離及抑菌活性驗(yàn)證，明確了供試菌劑在人參病害防治上的適用性，研究結(jié)果對(duì)于人參病害防治過程中微生物殺菌劑的選擇具有一定的指導(dǎo)意義和參考價(jià)值。

木霉菌分生孢子易受溫度、光照、溫度等環(huán)境因子影響，儲(chǔ)藏不當(dāng)極易造成分生孢子部分或全部失活[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，供試5份木霉菌劑中僅有1份分離到活體菌株，且數(shù)量很少，推測(cè)可能是菌劑流通過程中保存不當(dāng)所致。芽孢桿菌能夠產(chǎn)生內(nèi)生芽孢，對(duì)外界不良環(huán)境具有較強(qiáng)的耐受力[13]。本文研究結(jié)果也充分證實(shí)了上述觀點(diǎn)。全部供試5份芽孢桿菌可濕性菌劑均能大量分離到活體菌株。但是，2份芽孢桿菌水劑和微囊粒劑中分離到的活菌數(shù)量明顯偏低，由于2份菌劑與可濕性粉劑是同批次產(chǎn)品，說明兩種劑型并不適合芽孢桿菌的長(zhǎng)期保存。因此，建議盡可能購(gòu)買最新批次的木霉或芽孢桿菌菌劑產(chǎn)品，以確保防病效果。上述菌劑室內(nèi)抑菌活性僅作參考，實(shí)際防病效果以田間數(shù)據(jù)為準(zhǔn)。