劉 芳,曹婉秀,李兆杰,薛長湖,唐慶娟

(中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,人類健康實(shí)驗(yàn)室,山東青島 266003)

腎臟是機(jī)體排泄的主要場所,也是維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的主要器官。具有調(diào)節(jié)機(jī)體水鹽平衡、調(diào)節(jié)血壓以及排出機(jī)體代謝廢物等功能,與機(jī)體的工作能力有著密切的聯(lián)系。當(dāng)腎臟功能失調(diào)時,機(jī)體代謝異常,身體的毒素?zé)o法及時的排除,長時間的堆積會引發(fā)一系列的身體病變。因此,保護(hù)腎臟極其重要。然而,隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展,人們的工作強(qiáng)度隨之加大。研究發(fā)現(xiàn),工作強(qiáng)度過大會對腎臟造成嚴(yán)重的氧化損傷[1]。此時,組織會產(chǎn)生大量的氧自由基并發(fā)生氧化應(yīng)激。自由基的大量積累可激活NF-κB等,激活腎臟細(xì)胞中IL-6、MCP-1等[2]炎癥因子的表達(dá)。IL-6、MCP-1等炎癥因子過表達(dá)會引起腎小管損傷,甚至導(dǎo)致組織壞死。因此,尋找具有抗氧化、有效緩解腎臟炎癥、保護(hù)腎臟作用的功效因子迫在眉睫。

硫酸軟骨素(Chondroitin sulfate,CS)是一類聚合的多糖化合物,由重復(fù)的葡萄糖醛酸(GlcA)和N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)二糖單位組成,是一類存在于人和動物軟骨、結(jié)締組織中的具有特殊生物活性的酸性黏多糖。美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)認(rèn)定硫酸軟骨素為緩解關(guān)節(jié)炎的膳食補(bǔ)充劑,在歐洲已經(jīng)將硫酸軟骨素作為處方藥或非處方藥使用。在國內(nèi)也將其載入了2010版《中國藥典》。近年來,硫酸軟骨素被證實(shí)具有抗氧化[3]、有抗炎[4-5]、抗過敏[6]等多種生物學(xué)功效,被廣泛應(yīng)用于化妝品、功能食品、食品添加劑和醫(yī)藥領(lǐng)域中。作為一類聚合的多糖化合物,硫酸軟骨素多糖在小腸中難以吸收,主要通過結(jié)腸中腸道菌群的酵解作用[7]降解為二糖的形式再利用,即硫酸軟骨素二糖。有研究顯示,硫酸軟骨素的酶解產(chǎn)物二糖比硫酸軟骨素更容易被機(jī)體吸收利用且發(fā)揮更有效的生理活性[8-9]。目前,大量研究致力于對硫酸軟骨素二糖制備方法的優(yōu)化及體外抗氧化活性的探討。然而將分離的硫酸軟骨素二糖用于抗腎臟炎癥的研究尚未見報(bào)道。

因此,本文采用雞軟骨來源的硫酸軟骨素二糖,利用小鼠疲勞應(yīng)激模型,探討其對疲勞誘導(dǎo)的腎臟炎癥的改善作用,這將對開發(fā)具有保護(hù)腎臟功效作用的食品活性因子具有重要的指導(dǎo)作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

硫酸軟骨素二糖(81.21%的二糖的硫酸基團(tuán)位于N-乙酰半乳糖胺中的C4位置,即CS-4S) 青島貝爾特生物科技有限公司;C57BL/6J小鼠 健康、雄性SPF級,體重19～20 g,4周齡,許可證號:SCXK(京)2007-0001,購自北京維通利華技術(shù)有限公司;丙二醛(MDA)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒 批號20150430、20150250,南京建成科技有限公司;TRIZOL試劑 美國Invitrogen公司;M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶 美國Promega公司;2×PCR mix 批號20160608101-2,北京博邁德科技發(fā)展有限公司;FastStart Univeral SYBR Green Master(Rox) 美國Roche公司;引物 上海生工生物工程有限公司;β-Actin-HRP抗體美國Santa Cruz Biotechnology公司;兔抗小鼠NF-κB、MCP-1、IL-6多克隆抗體 百靈威科技有限公司;羊抗兔IgG-HRP、MCP-1和IL-6抗體 北京博奧森生物科技有限公司;蛋白質(zhì)裂解液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒(編號P0012)上海碧云天生物技術(shù)研究所;脫脂奶粉 美國BD公司。

YLS-10B型電動輪跑步機(jī) 山東醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供;Nanodrop 2000/2000C型分光光度計(jì) 美國Thermo Scientific公司;iQ5型熒光定量PCR儀、Model 680型酶標(biāo)儀 美國伯樂Bio-rad公司;Mastercycler personal PCR儀 德國Eppendorf AG公司;24D型垂直電泳槽和脫色搖床 北京六一儀器廠;SⅡ型半干轉(zhuǎn)膜儀 大連競邁生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動物分組與干預(yù) 24只實(shí)驗(yàn)小鼠于動物培養(yǎng)中心適應(yīng)飼養(yǎng)一周后,根據(jù)體重隨機(jī)分成正常組(N組)、疲勞應(yīng)激組(M組)、正常小鼠灌胃硫酸軟骨素二糖組(CS組)、疲勞應(yīng)激小鼠灌胃硫酸軟骨素二糖組(S組)。小鼠飼養(yǎng)在專門動物飼養(yǎng)籠內(nèi),室溫20～25 ℃,12/12 h光/暗周期,標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng),自由飲用蒸餾水。將M和S組小鼠分別置于電動輪跑步機(jī)上,持續(xù)運(yùn)動3 h(速度:20 r/min),持續(xù)2 d后恢復(fù)5 d。實(shí)驗(yàn)周期為16 d,共運(yùn)動6 d。N和CS組保持正常生活狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)期間S組和CS組每天灌胃150 mg/kg·bw硫酸軟骨素二糖,N組和M組每天灌胃等量的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)。第17 d將小鼠摘眼球取血,脫頸椎處死取腎臟。

1.2.2 腎臟組織中SOD活力和MDA含量的測定 將小鼠腎臟組織從-80 ℃冰箱中取出,用RIPA裂解液冰浴勻漿。4 ℃勻漿30 min后,于12000 r/min、4 ℃離心5 min,取上清液。將樣品稀釋50倍后,用BCA試劑盒檢測蛋白濃度。后續(xù)操作參考SOD和MDA檢測試劑盒說明書。

1.2.3 Real-time PCR方法檢測炎癥相關(guān)基因的表達(dá) 將腎組織按照每0.1 g組織加1 mL TRIZOL的比例,4 ℃下勻漿后將勻漿液倒入1.5 mL滅酶離心管中,每管加入200 μL氯仿后，室溫靜置10 min。4 ℃ 12000 r/min離心15 min,將上清液轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中,加入與上清液等體積的異丙醇,室溫靜置10 min。在4 ℃下12000 r/min離心10 min,用75%乙醇清洗后得到沉淀。加適量DEPC水(用焦碳酸二乙酯處理后，并經(jīng)高溫高壓滅菌的MiliQ純水),溶解沉淀。取10 μL 1200 ng/μL RNA加入滅酶PCR小管中,加2 μL隨機(jī)引物、5 μL 5×M-MLV buffer、dNTP 0.5 μL、RNase Inhibitor 1 μL、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶1 μL和DEPC水4.5 μL。進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,反應(yīng)程序?yàn)?30 ℃,10 min;37 ℃,60 min;90 ℃,5 min;4 ℃ forever。反應(yīng)結(jié)束后即得cDNA樣品。然后進(jìn)行RT-PCR反應(yīng),25 μL反應(yīng)體系為SYBR Green 12.5 μL,上、下游引物各0.75 μL,樣品cDNA 2.5 μL,超純水8.5 μL。反應(yīng)條件為:95 ℃,10 min;95 ℃,15 s,60 ℃,20 s,95 ℃,15 s(45個循環(huán));65 ℃升溫至95 ℃(0.5 ℃/10 s)。毎個基因的mRNA表達(dá)量均與GAPDHmRNA表達(dá)量相比,引物序列見表1,由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 引物序列Table 1 Specific primer sequences for Real time PCR

1.2.4 Western blot檢測腎臟組織中蛋白表達(dá) 取0.1 g組織,加入預(yù)冷的RIPA組織裂解液,至于冰上用勻漿機(jī)充分裂解。4 ℃孵30 min,12000 r/min離心5 min(4 ℃),取上清液用BCA試劑盒測定其蛋白濃度。樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳,濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜2 h后轉(zhuǎn)至聚偏氧乙烯(PVDF)膜上。PVDF膜用含5%脫脂奶粉的封閉液封閉2 h后,將上述PVDF膜放入適宜濃度的一抗中4 ℃孵育過夜。洗膜后以辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗于室溫下孵育2 h。采用化學(xué)熒光法進(jìn)行成像。以β-actin為內(nèi)參分析各組目的蛋白的表達(dá)量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 硫酸軟骨素二糖對疲勞應(yīng)激小鼠腎臟SOD活力和MDA含量的影響

疲勞應(yīng)激損傷與組織中自由基的積累息息相關(guān)。當(dāng)腎臟中超氧化物歧化酶(SOD)無法有效清除組織中的自由基時,脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)產(chǎn)生增加,進(jìn)而造成組織細(xì)胞損傷[10]。如圖1所示,與N組相比,疲勞應(yīng)激下M組腎臟組織中的SOD活力略微下降,但無顯著性差異(p>0.05),而MDA的含量極顯著增加(p<0.01)。由此說明,M組建模成功,疲勞應(yīng)激會導(dǎo)致機(jī)體的氧化應(yīng)激損傷。當(dāng)疲勞應(yīng)激小鼠極顯著增加(p<0.01),灌胃硫酸軟骨素二糖后,S組小鼠腎臟組織中SOD活力顯著升高(p<0.05),而MDA含量極顯著下降(p<0.01)。硫酸軟骨素二糖也可以極顯著增加正常小鼠腎臟組織中的SOD活性(p<0.01),而對MDA含量無顯著性的影響(p>0.05)。因此可得,一定劑量的硫酸軟骨素二糖具有增加腎臟組織中SOD活性,改善機(jī)體氧化應(yīng)激損傷的功效。

圖1 硫酸軟骨素二糖對小鼠腎臟中SOD酶活力和MDA含量的影響Fig.1 Effects of chondroitin disccharide on the activity of SOD activity and MDA content in kidney of mice注:*表示p<0.05,**表示p<0.01;圖2、圖3同。

2.2 硫酸軟骨素二糖對疲勞應(yīng)激小鼠腎臟炎癥因子mRNA表達(dá)量的影響

如圖2所示,與N組相比,疲勞應(yīng)激M組會極顯著增加TGF-β1和NF-κB的mRNA的表達(dá)量(p<0.01),進(jìn)而極顯著增加下游IL-6和MCP-1mRNA的表達(dá)(p<0.01)。疲勞狀態(tài)下攝入硫酸軟骨素二糖后,與M組相比,S組小鼠腎臟中TGF-β1和NF-κB的mRNA的表達(dá)量無顯著性變化(p>0.05),而促炎因子IL-6和MCP-1mRNA表達(dá)量極顯著降低(p<0.01)。在正常狀態(tài)下,硫酸軟骨素二糖(CS組)對小鼠腎臟組織中炎癥因子的表達(dá)沒有顯著性的影響(p>0.05)。由此可知,一定劑量的硫酸軟骨素二糖的攝入可以改善疲勞誘導(dǎo)的促炎因子IL-6和MCP-的mRNA高表達(dá)。

圖2 硫酸軟骨素二糖對小鼠腎臟中炎癥因子mRNA相對表達(dá)量的影響Fig.2 Effects of chondroitin disaccharides on the mRNA expression of proinflammatory cytokines in kidney of mice

2.3 硫酸軟骨素二糖對疲勞應(yīng)激小鼠腎臟炎癥因子蛋白表達(dá)量的影響

如圖3所示,與N組相比,CS組的NF-κBp65、IL-6和MCP-1的蛋白表達(dá)水平無顯著性變化(p>0.05)。疲勞應(yīng)激狀態(tài)下,M組小鼠腎臟中相關(guān)促炎因子NF-κBp65(p<0.05)、IL-6和MCP-1(p<0.01)的蛋白表達(dá)量顯著性增加;與M組相比,S組小鼠腎臟組織中NF-κBp65的蛋白表達(dá)量無顯著性變化(p>0.05),但I(xiàn)L-6和MCP-1蛋白表達(dá)量顯著性降低(p<0.05)。以上結(jié)果表明,一定劑量的硫酸軟骨素二糖可以降低腎臟由于疲勞應(yīng)激引發(fā)的炎癥因子過表達(dá),改善炎癥反應(yīng),保護(hù)腎臟。

圖3 小鼠腎臟中NF-κB p65、IL-6和MCP-1的蛋白相對表達(dá)量Fig.3 Relative protein expression of NF-κB p65、IL-6 and MCP-1 in kidney

3 討論與結(jié)論

疲勞損傷與機(jī)體炎癥和氧化應(yīng)激緊密相關(guān)[11]。前期研究證明,疲勞應(yīng)激狀態(tài)下,腎臟皮質(zhì)呈現(xiàn)白色的缺血水腫狀態(tài),組織腎小管形態(tài)出現(xiàn)嚴(yán)重?fù)p傷[12]。缺血的腎臟組織恢復(fù)血流后,組織則會產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng),這也是目前認(rèn)為腎缺血再灌注損傷的機(jī)制之一。灌胃硫酸軟骨素二糖(150 mg/kg·bw)能夠極顯著改善疲勞導(dǎo)致的腎臟組織中抗氧化酶SOD活力并降低MDA含量(p<0.01)。此結(jié)果提示硫酸軟骨素二糖可以通過改善腎臟的氧化應(yīng)激保護(hù)腎臟的疲勞損傷。

IL-6、MCP-1等炎癥因子表達(dá)會引起腎小管損傷,甚至導(dǎo)致組織壞死。IL-6是參與炎癥反應(yīng)的重要因子之一[13],其濃度變化與腎臟的病理改變具有一致性[14]。MCP-1是機(jī)體中具有特異性趨化作用的趨化因子,其表達(dá)量在腎臟病變組織中極顯著增加(p<0.01)。本研究結(jié)果表明,疲勞應(yīng)激組(M組)的腎臟組織中IL-6和MCP-1的基因和蛋白表達(dá)量均極顯著升高(p<0.01)。硫酸軟骨素二糖的攝入有效地降低了兩者的表達(dá)量。因而硫酸軟骨素二糖對腎臟組織炎癥具有明顯的改善作用。

綜上所述,一定劑量的硫酸軟骨素二糖對疲勞導(dǎo)致的小鼠腎臟炎癥具有明顯的改善效果,其改善作用可能與其緩解組織氧化應(yīng)激相關(guān)。本研究為硫酸軟骨素二糖在改善腎臟應(yīng)激損傷的功能食品開發(fā)中奠定了理論基礎(chǔ)。但是,硫酸軟骨素二糖的食用劑量以及長期服用后的毒副作用仍需要進(jìn)一步研究,其保護(hù)腎臟的作用機(jī)制仍需要進(jìn)一步探討。