胡璇 葉俊釗 廖獻花 邵琮翔 李福曦 鐘碧慧

中山大學附屬第一醫(yī)院消化科（廣州 510080）

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）導致慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B）的發(fā)生，是肝硬化甚至肝癌的主要病因，造成嚴重后果。乙型肝炎e抗原（hepatitis B e antigen，HBeAg）血清學轉(zhuǎn)換能夠改善HBV感染免疫調(diào)控，有效降低患者終末期肝病發(fā)生風險，是抗病毒治療的重要目標[1]。研究證明白細胞介素?21（interleukin?21，IL?21）及其下游效應細胞因子干擾素?γ（interferon?γ，IFN?γ）能夠有效抑制HBV復制，促進HBV感染患者抗病毒治療的結(jié)局轉(zhuǎn)歸[2-3]?；颊呖共《久庖邞鸱磻c自身遺傳背景的相關(guān)性逐漸受到廣泛關(guān)注與探討，炎癥性細胞因子基因多態(tài)性與HBV感染患者預后轉(zhuǎn)歸的關(guān)聯(lián)尚不明確[4-5]。

本研究通過檢測接受核苷酸類似物治療的乙型肝炎患者IL?21及其受體和IFN基因特定位點基因多態(tài)性，分析它們與HBeAg血清學轉(zhuǎn)換和乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）下降幅度的關(guān)系，旨在明確特定位點基因多態(tài)性對慢性乙型肝炎療效血清學應答的影響，為患者個體化治療提供有力證據(jù)。

1 對象與方法

1.1 病例來源和診斷標準選取2015年1月至2017年12月中山大學附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科門診就診的慢性乙型肝炎患者，根據(jù)我國《慢性乙型肝炎防治指南》（2015更新版）診斷標準[6]，符合口服核苷酸類似物抗病毒治療指征，已接受規(guī)律抗病毒治療3年以上，HBV?DNA＜100 IU/mL且剪切波彈性成像（shear wave elastography，SWE）檢測值均小于10 kPa。入選病例共200例，按照治療3年后是否發(fā)生HBeAg血清學轉(zhuǎn)換分為HBeAg血清學轉(zhuǎn)換組（轉(zhuǎn)換組）和非轉(zhuǎn)換組（對照組），其中轉(zhuǎn)換組50例，對照組150例。排除標準：（1）其他病毒感染性肝病，膽道相關(guān)疾病，遺傳代謝性肝病，自身免疫性肝病及終末期肝病等；（2）長期飲酒酗酒史（男 ＞40 g/d，女 ＞20 g/d，超過5年；或者2周內(nèi)大量飲酒史，＞80 g/d）；（3）正在接受免疫調(diào)節(jié)治療或干擾素治療患者；（4）自身免疫性疾病包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風濕性關(guān)節(jié)炎、甲狀腺功能亢進等；（5）藥物濫用；（6）妊娠或哺乳。

1.2 研究方法

1.2.1 血清學指標空腹6～8 h無菌條件下采集靜脈血并完成以下指標檢測：血常規(guī)，常規(guī)生物化學指標包括丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（GGT）、總膽紅素、白蛋白、血尿酸、血肌酐、尿素氮、空腹血糖、空腹胰島素，乙肝血清學標志物（HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb），HBV?DNA定量，甲胎蛋白（AFP）。

1.2.2 單核苷酸多態(tài)性（single?nucleotide poly?morphism，SNP）分型檢測HapMap數(shù)據(jù)庫中篩選IL?21、IL?21R和IFN尚未見文獻報道或已在免疫方向文獻報道較多的SNP位點，并選擇等位基因頻率＞0.05的多態(tài)性位點。最終遴選15個SNP位點（IL?21rs13143866，rs10032644，rs12505138，rs12508721，rs17005929，rs6840978，IL?21Rrs2214537，rs8057551，rs8061992，rs3093390，rs3093301，IFNA rs1831391，rs674189，IFNG rs7956688，rs2069705）采用Assay Designer 3.1軟件進行引物設(shè)計PCR反應和單堿基擴展引物。MassArray技術(shù)進行SNP分型檢測。步驟如下：美國Agena公司基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI?TOF MS）對200個樣本15個位點進行檢測，經(jīng)PCR擴增反應，產(chǎn)物堿性磷酸酶處理及單堿基延伸反應后，啟動MassARRAY Nanodispenser RS1000點樣儀芯片點樣，MALDI?TOF質(zhì)譜儀（MassARRAY Analyzer 4.0）分析點樣后的芯片，TYPER4.0軟件獲取原始數(shù)據(jù)及基因分型圖。

1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS 20.0統(tǒng)計分析軟件，正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差進行統(tǒng)計學描述，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用中位數(shù)及四分位數(shù)間距進行統(tǒng)計學描述。定量資料采用t檢驗或者非參數(shù)檢驗，定性資料采用卡方檢驗，基因頻率及基因型頻率采用卡方檢驗或者Fisher精確概率法，多元回歸分析采用相對危險度（odds ratio，OR）和95%置信區(qū)間（95%confidence interval，95%CI）表示，哈迪-溫伯格平衡（hardy?weinberg equilibrium，HWE）檢測 采 用 SHEsis軟 件（http：//analysis.bio?x.cn/my?Analysis.php）。所有數(shù)據(jù)均使用雙側(cè)檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料共納入臨床資料完整的200例患者，其中轉(zhuǎn)換組50例，對照組150例，兩組間年齡、性別比較差異無統(tǒng)計學意義。轉(zhuǎn)換組的HBsAg濃度水平、ALT水平和AFP水平均顯著高于對照組（P值依次為0.012、0.010、0.035，表1）。

2.2 IL?21及其受體與IFN基因多態(tài)性預測HBeAg血清學轉(zhuǎn)換分析SNP分型檢測原始結(jié)果見圖1。15個SNP位點中共發(fā)現(xiàn)7個HBeAg血清學轉(zhuǎn)換陽性關(guān)聯(lián)位點（表2），均具有群體代表性（基因型分布均符合HWE平衡，P＞0.05），分別是IL?21 rs12505138（A ＞G）等位基因A（36.0%vs.23.8%，P=0.017）及 AA基因型（14.0%vs.5.3%，P=0.045）、rs17005929（T ＞ C）等位基因T（35.0%vs.23.5%，P=0.024）、rs6840978（C＞ T）等位基因C（93.0%vs.83.9%，P=0.022）、IL?21R基因rs8057551（A ＞G）等位基因A（60.0%vs.46.0%，P=0.015）及 AA基因型（40.0%vs.22.1%，P=0.023）、rs8061992（C＞A）等位基因C（62.0%vs.47.7%，P=0.013）及CC基因型（44.0%vs.23.5%，P=0.027）、rs3093301（T＞C）TT基因型（34.0%vs.20.0%，P=0.043）和IFNA基因rs1831391（A ＞C）等位基因A（54.1%vs.41.2%，P=0.026）及AA基因型（26.5%vs.26.9%，P=0.026）在轉(zhuǎn)換組中的頻率均顯著高于對照組。其中IL?21 rs12505138，rs17005929及IFNA rs1831391尚未見文獻報道。

表1 轉(zhuǎn)換組與對照組的基線資料Tab.1 Baseline characteristics of HBeAg seroconversion group and control group

圖1 SNP分型原始結(jié)果Fig.1 The original results of SNP

2.3 HBeAg血清學轉(zhuǎn)換陽性關(guān)聯(lián)位點基因型與HBsAg下降幅度的關(guān)系200例患者中共126例繼續(xù)原抗病毒藥物治療并隨訪至第48周（轉(zhuǎn)換組42例，對照組84例）。在基線或隨訪第48周HBsAg比較發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)換組相比對照組HBsAg水平明顯更低（基線：3.25±0.62vs.3.52±0.66 Log10IU/mL，P=0.012，48周：3.06±0.79vs.3.41±0.67 Log10IU/mL，P=0.011），但基線至隨訪第48周的HBsAg下降幅度（△HBsAg）組間比較差異無統(tǒng)計學意義（0.11±0.28vs.0.11±0.20 Log10IU/mL，P=0.887）（表3）。而繼續(xù)將△HBsAg與7個陽性關(guān)聯(lián)位點基因型進行單因素和多因素分析比較發(fā)現(xiàn)，攜帶IFNA rs1831391CC基因型與HBsAg下降幅度獨立相關(guān)（β=-0.200，95%CI：-0.122～-0.008，P=0.027），其他6個陽性位點與HBsAg下降幅度差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。

3 討論

流行病學調(diào)查結(jié)果顯示我國普通人群HBsAg攜帶率為7%，HBV感染導致的終末期肝硬化和肝癌所占比例高達60%～80%，HBV的高度流行對家庭、社會乃至國家?guī)順O大的經(jīng)濟壓力與健康影響，造成嚴重的社會危害[7-8]。直接抗病毒藥物即核苷類似物是現(xiàn)階段慢性HBV感染患者的基本治療藥物，以往Ⅲ期臨床試驗數(shù)據(jù)提示，規(guī)律接受替諾福韋治療患者第48周HBeAg血清學轉(zhuǎn)換率為21%，恩替卡韋治療患者第96周HBeAg血清學轉(zhuǎn)換率為31%，而藥物上市后實際數(shù)據(jù)顯示接受治療患者中HBeAg血清學清除率遠未達到該比例[9-11]。

IL?21及IFN?γ是調(diào)節(jié)免疫應答過程中的重要細胞因子，其血清學水平也被證實與肝臟疾病的嚴重程度密切相關(guān)，已被認為是抑制HBV的重要分子[2，12]。一項納入395例慢性HBV感染患者、75例HBV自愈和174例健康對照的研究發(fā)現(xiàn)，HBV感染患者攜帶 IL?21 rs2221903/IL?21R rs3093301 AA/CC基因型相比AA/CT或AA/TT基因型具有更高的IL?21及IgE水平，提示攜帶IL?21R rs3093301CC基因型在HBV感染中可誘導更高的IL?21及IgE水平繼而影響HBV感染免疫狀態(tài)[13]。

本研究以探討HBV感染抗病毒治療患者IL?21與IFN相關(guān)基因多態(tài)性與血清學應答的關(guān)聯(lián)為目的，通過分析規(guī)律核苷酸類似物抗病毒治療3年后實現(xiàn)HBeAg血清學轉(zhuǎn)換患者（轉(zhuǎn)換組）和尚未發(fā)生HBeAg血清學轉(zhuǎn)換患者（對照組）數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，檢測的15個SNP位點中共7個位點特定等位基因或基因型頻率在轉(zhuǎn)換組顯著高于對照組，有助于預測HBV抗病毒治療患者HBeAg血清學轉(zhuǎn)換。其中有3個位點既往未見國內(nèi)外的文獻報道，分別為IL?21 rs12505138（A ＞ G）、rs17005929（T ＞ C）和IFNA rs1831391（A＞C），首次在中國漢族人群中檢測出其單核苷酸多態(tài)性，為中國HBV感染患者抗病毒治療提供了新的數(shù)據(jù)支持。此外，IL?21 rs6840978被證實是炎癥性腸病的易感位點，并指出其與潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生密切相關(guān)[14]，而在HBV感染中未見相關(guān)報道，本研究結(jié)果提示攜帶rs6840978等位基因C患者相較于等位基因T患者經(jīng)抗病毒治療后發(fā)生HBeAg血清學轉(zhuǎn)換率更高（93.0%vs.83.9%，P=0.022）。IL?21R rs8057551、rs8061992僅在一項白人受試者研究中發(fā)現(xiàn)其單核苷酸多態(tài)性與骨代謝相關(guān)，為骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生提供了遺傳學依據(jù)[15]。而本研究證實轉(zhuǎn)換組中rs8057551（A＞G）等位基因A及AA基因型、rs8061992（C＞A）等位基因C及CC基因型頻率顯著高于對照組（均P＜0.05）。同時本研究發(fā)現(xiàn)IL?21R rs3093301 TT基因型相較于CC/CT在抗病毒治療中患者實現(xiàn)HBeAg血清學轉(zhuǎn)換的預測作用（34.0%vs.20.0%，P=0.043），該結(jié)果與前人報道結(jié)果一致[13]。

表2 IL?21及其受體和IFN基因HBeAg血清學轉(zhuǎn)換陽性關(guān)聯(lián)位點基因頻率及基因型分布Tab.2 Allele and genotype frequencies of HBeAg seroconversion associated SNPs in IL?21，IL?21R and IFN gene例（%）

表3 轉(zhuǎn)換組與對照組不同時期HBsAg及差值比較結(jié)果Tab.3 Comparison of HBsAg loss between HBeAg seroconversion group and control group ±s

表3 轉(zhuǎn)換組與對照組不同時期HBsAg及差值比較結(jié)果Tab.3 Comparison of HBsAg loss between HBeAg seroconversion group and control group ±s

注：△HBsAg，HBsAg下降幅度

例數(shù)42 84組別轉(zhuǎn)換組對照組P值HBsAg（Log10IU/mL）基線3.25±0.62 3.52±0.66 0.012 48周3.06±0.79 3.41±0.67 0.011△HBsAg 0.11±0.28 0.11±0.20 0.887

HBsAg清除亦是HBV感染抗病毒治療患者臨床療效和隨訪過程中重點關(guān)注的方面，持續(xù)高水平的HBsAg濃度加劇患者肝臟相關(guān)事件的發(fā)生。本研究進一步將HBeAg血清學轉(zhuǎn)換陽性關(guān)聯(lián)位點基因多態(tài)性與隨訪48周HBsAg下降幅度分析發(fā)現(xiàn)攜帶IFNA rs1831391 CC基因型與HBsAg下降幅度獨立相關(guān)，該結(jié)果為抗病毒治療患者尋找臨床治愈線索提供新的方向與思路。

本研究在中國人群檢測發(fā)現(xiàn)7個HBeAg血清學轉(zhuǎn)換陽性關(guān)聯(lián)位點，其中包括3個國內(nèi)外未見報道的新發(fā)現(xiàn)位點，2個與其他疾病相關(guān)但首次發(fā)現(xiàn)與HBV感染相關(guān)的位點，均有助于預測慢性乙型肝炎療效血清學應答。本研究的不足之處有：（1）陽性位點的功能驗證有待繼續(xù)完善；（2）乙型肝炎患者治療隨訪時間尚需適當延長以進一步驗證療效。本研究為在宿主自身遺傳背景相關(guān)的IL?21及其受體和IFN特定位點SNP多態(tài)性與乙型肝炎治療中患者抗病毒免疫功能及血清學清除的關(guān)系探討方面提供了有力的證據(jù)支持，給乙型肝炎患者臨床治療領(lǐng)域帶來新的理念和希望。