王京偉 李艷 喬斌 陳娟娟

武漢大學人民醫(yī)院檢驗科（武漢 430060）

他汀類藥物（statins），亦作羥甲基戊二酰輔酶A（hydroxymethyl?glutaryl coenzyme A，HMG?CoA）還原酶抑制劑，是臨床降脂的首選藥物，也是預防心腦血管疾病的重要藥物之一。然而，他汀類藥物的使用存在較大個體差異，部分患者可出現(xiàn)如肌肉毒性、肝毒性、神經(jīng)毒性及胃腸道反應等不良反應，給臨床醫(yī)生在藥物選擇、用藥劑量個體化及預后評估等方面均帶來困擾。研究發(fā)現(xiàn)他汀類藥物不良反應與遺傳因素相關，尤其與有機陰離子轉運多肽（organic anion transporting polypeptide 1B1，OATP1B1）編碼基因SLCO1B1及載脂蛋白E（apolipoprotein E，ApoE）基因的單核甘酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）密切相關，SLCO1B1與ApoE的不同基因型對藥物的療效及不良反應差異巨大[1]。而我國由于遺傳背景的差異他汀類藥物使用不良反應的發(fā)生率遠高于歐美國家[8]。因此進行APOE及SLCO1B1基因型檢測對用藥不良反應的風險提示具有重要的輔助診斷意義，可以協(xié)助臨床對患者實施個體化用藥指導[2]。本研究采用聚合酶鏈反應（PCR）-熒光探針法對華中地區(qū)心腦血管疾病患者和健康人群同時進行SLCO1B1和APOE基因多態(tài)性位點分析，從分子水平分析華中地區(qū)SLCO1B1和APOE基因多態(tài)性分布，為華中地區(qū)心腦血管疾病的防止和個體化治療提供理論基礎?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料分別收集從2016年1月至2017年6月武漢大學人民醫(yī)院就診并接受SLCO1B1和ApoE基因多態(tài)性檢測的患者的EDTA?K抗凝靜脈血918份，采用多重PCR-探針法對SLCO1B1和ApoE進行基因的多態(tài)性位點分析。就診患者年齡19～99歲，平均年齡（60.06±14.26）歲，其中男604例，平均年齡（59.80±14.10）歲，女314例，平均年齡（60.68±14.50）歲。所有入選者籍貫均為華中地區(qū)漢族人，無血緣關系和異族通婚史。

1.2 儀器和試劑QuantStudio Dx實時熒光定量PCR儀（美國Life Technologies公司）；Smart LabAss?ist?32核酸自動純化提取儀（臺灣圓點奈米技術開發(fā)有限公司）；全血基因組核酸提取及純化試劑（上海星耀醫(yī)學科技發(fā)展有限公司）；Nanodrop 2000超微量分光光度計（美國NanoDrop公司）；人類SLCO1B1和ApoE基因多態(tài)性檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）（武漢友芝友醫(yī)療科技有限公司，批號：18050904質(zhì)控：試劑盒自帶SLCO1B1基因*1b和*5和ApoE基因ε2和ε4弱陽性質(zhì)控及空白對照）。實驗所用的內(nèi)參基因由武漢友芝友醫(yī)療科技有限公司生產(chǎn)。

1.3 SLCO1B1和ApoE基因多態(tài)性檢測

1.3.1 基因組DNA提取采集受檢者靜脈血2 mL，乙二胺四乙酸二鉀抗凝，采用全血基因組核酸提取及純化試劑提取基因組DNA，按試劑盒說明書進行操作。在96孔預裝板的第1列和第7列加入全血樣本400 μL，分別在提取反應板中第1列和第 7 列加入蛋白酶 20 μL，選擇 Smart LabAssist?32核酸自動純化提取儀上相應的提取程序進行自動化核酸提取。運行結束后第5列和第11列對應槽位為相應標本提取的DNA。用Nanodrop2000超微量分光光度計測量DNA的濃度與純度，A260/A280在1.8～2.0，A260/A230＞2。根據(jù)定量濃度將DNA樣本稀釋至5～15 ng/μL進行PCR擴增檢測，基因組DNA原液-20℃保存。

1.3.2 PCR擴增將23 μL SLCO1B1*1b反應液、SLCO1B1*5反應液、ApoE2反應液、ApoE4反應液及內(nèi)標反應液依次加入到200 μL PCR 8聯(lián)管內(nèi)，再依次加入2 μL基因組DNA，總體積25 μL。同時做弱陽性對照和空白對照。將PCR反應管放置擴增儀中進行擴增，擴增程序為：37℃10 min，95℃預變性5 min；擴增階段95℃變性15 s，60℃延伸60 s（設置在此階段結束時采集熒光信號），共40個循環(huán)，反應體系為25 μL。熒光信號采集為FAM 通道（SLCO1B1*1b 388A、SLCO1B1*5 521T、ApoE2 526C和ApoE4 388T）、VIC通道（SLCO1B1*1b 388G、SLCO1B1*5 521C、ApoE2 526T和ApoE4 388C）和ROX通道（內(nèi)標基因）。

1.3.3 結果判斷試劑盒有效性判定：弱陽性對照：FAM、VIC、ROX通道Ct值 ≤ 32，擴增曲線有明顯指數(shù)增長期。空白對照：FAM、VIC、ROX通道無擴增曲線，或者擴增曲線為直線或輕微斜線，無明顯指數(shù)增長期，無Ct值或Ct值≥38。樣本有效性的判定：內(nèi)標基因（ROX通道）的Ct值＜38，擴增曲線有明顯指數(shù)增長期。樣本基因多態(tài)性判定：相應通道的Ct值＜38，擴增曲線有明顯指數(shù)增長期，則該通道代表的基因型為陽性。若Ct值≥38或無Ct值，則該通道代表的基因型為陰性。若僅FAM通道Ct值＜38，ROX通道的Ct值≥38或無Ct值則判斷為純和野生型；若僅ROX通道Ct值＜38，F(xiàn)AM通道的Ct值≥38或無Ct值則判斷為純和突變型；若FAM通道與ROX通道的Ct值均＜38，則判斷為雜合型。

1.4 統(tǒng)計學方法各SNP位點的基因型頻率和等位基因頻率通過頻率計算法計算。采用χ2檢驗分析各SNP位點是否符合Hardy?Weinberg遺傳平衡，采用統(tǒng)計軟件SPSS 21.0進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料以例數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 華中地區(qū)SLCO1B1與apoE基因多態(tài)性分布SLCO1B1基因388A＞G、521T＞C兩個位點多態(tài)性與他汀類用藥相關，攜帶突變基因的人群轉運蛋白功能降低，因此發(fā)生肌病等副作用的風險較正常人群更高。兩個位點可形成4種單倍型：SLCO1B1*1a（388A ?521T），SLCO1B1*1b（388G ?521T），SLCO1B1*5（388A?521C），SLCO1B1*15（388G?521C）[3-4]，和九種不同表型：*1a/*1a，*1a/*1b，*1b/*1b，*1a/*5，*1a/*15，*1b/*15，*5/*5，*5/*15，*15/*15，華中地區(qū)人群九種表型占比為7.63%、30.83%、40.96%、0.22%、5.12%、13.94%、0%、0%、1.31%，詳見表1。根據(jù)服用他汀類藥物后發(fā)生橫紋肌溶解癥或肌病的風險及服用藥物的劑量將其分為正常代謝型（*1a/*1a，*1a/*1b，*1b/*1b）、中間代謝型（*1a/*5，*1a/*15，*1b/*15）患、弱代謝型（*5/*5，*5/*15，*15/*15）三類。華中地區(qū)上述三類患者的人群占比分別為79.41%，19.28%和1.31%，弱代謝型人群肝臟攝取藥物能力較差，發(fā)生橫紋肌溶解癥或肌病風險較突變型患者高，需減少他汀類藥物使用劑量[5]，是臨床需要關注的對象。

ApoE基因388T＞C，526C＞T兩個位點與他汀類藥物的療效相關，可產(chǎn)生三種不同的基因亞型 Apoε2（388T?526T），Apoε3（388T?526C），Apoε4（388C?526C）和 6種不同表型：E2/2、E2/3、E2/4、E3/3、E3/4 和 E4/4[3，6]，其中，ApoE3/3 是野生型（Wild?type）。6種表型占比為0.64%、1253%、2.07%、68.41%、14.81%、1.53%，見表1。

根據(jù)不同基因型發(fā)生冠心病、心梗、腦梗、老年癡呆等的風險及服用他汀類藥物的療效將其分為三大類[7-9]，APOE保護類基因型（ε2/ε2，ε2/ε3），APOE 大眾類基因型（ε2/ε4，ε3/ε3）和 APOE 風險類基因型（ε3/ε4，ε4/ε4），華中地區(qū)這三類人群的占比分別為13.18%。70.48%和16.34%，詳見表1。各個基因型之間的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表1）。

表1 華中地區(qū)SLCO1B1和ApoE基因多態(tài)性分布結果Tab.1 General data of patients in Central China with different SLCO1B1 and ApoE genotypes

2.2 不同性別SLCO1B1和ApoE基因多態(tài)性分布差異男性患者的SLCO1B1基因的*1a/*1a、*1a/*1b、*1b/*1b、*1a/*5、*1a/*15、*1b/*15、*5/*5、*5/*15和*15/*15表型所占比例分別為8.11%、30.13%、41.56%、0.33%、3.97%、14.24%、0%、0%、1.66%。女性患者各亞型所占比例分別為6.69%、32.17%、39.81%、0%、7.32%、13.38%、0%、0%、0.64%。男女患者SLCO1B1正常代謝型占比最重，分別為80.33%和78.66%，中間代謝型為18.54%和20.70%，弱代謝型為1.66%和0.64%。不同性別間除1a/15型有差異外其它各亞型間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖1A。

男性患者ApoE 基因ε2/ε2、ε2/ε3、ε2/ε4、ε3/ε 3、ε3/ε4 和 ε4/ε4 表 型 所 占 比例分別為 0.99%、11.59%、2.15%、69.21%、14.40%、1.66%，女性依次為0%、14.33%、1.91%、66.88%、15.61%、1.27%。男女性患者ApoE大眾類基因型占比最重，分別為71.36%和68.79%，保護類基因型為12.58%和14.33%，風險類基因型為16.06%和16.88%。不同性別間各表型之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖1B。

2.3 華中地區(qū)基因型分布及等位基因頻率分布基因型和各等位基因頻率見表2，918例華中地區(qū)漢族人群中，SLCO1B1基因的388A＞G（rs2306283）位點共檢測出野生型72例，雜合突變型330例，純合突變型516例，等位基因突變發(fā)生率為74.18%。SLCO1B1基因的521T＞C（rs4149056）位點共檢測出野生型729例，雜合突變型177例，純合突變型12例，等位基因突變發(fā)生率為10.95%。

918例華中地區(qū)漢族人群中APOE基因的388T＞C（rs429358）位點共檢測出野生型749例，雜合突變型155例，純合突變型14例，等位基因突變發(fā)生率為9.97%。APOE基因的526C＞T（rs7412）位點共檢測出野生型778例，雜合突變型134例，純合突變型6例，等位基因突變發(fā)生率為7.95%。

圖1 不同性別間SLCO1B1和ApoE基因多態(tài)性分布結果Fig.1 Distribution of SLCO1B1 and ApoE genotypes between different sexes

表2 SLCO1B1和ApoE基因多態(tài)性頻率分布Tab.2 Frequency distribution of SLCO1B1 and ApoE genotypes

經(jīng)χ2檢驗，SLCO1B1及APOE基因的上述多態(tài)性位點突變頻率觀察值符合Hardy?wenberg遺傳平衡（P＞0.05），具有群體代表性。

3 討論

他汀類藥物不良反應相關的癥狀（statin?asso?ciate symptom，SAS），如肌肉癥狀、肝臟損害、中樞神經(jīng)癥狀、糖尿病等[10-11]是導致患者早期減藥或停藥的主要原因之一。此外，長期服用他汀類可誘發(fā)輕度認知障礙或永久的癡呆[12]，減藥或停藥則可增加臨床動脈粥樣硬化性心血管疾病事件。因此，他汀類藥物使用的獲益與潛在風險間的評估已成為醫(yī)患共同關注的問題。SLCO1B1和ApoE基因的SNP是藥物代謝個體差異的分子基礎，也是影響藥物相互作用的重要原因。

位于12號染色體上的SLCO1B1基因的388A＞G、521T＞C多態(tài)性可引發(fā)功能缺陷，導致他汀藥效和毒副作用的個體差異，是明確的遺傳影響因素。SLCO1B1基因的388G會增加OATP1B1對某些他汀類藥物的轉運能力，個體血脂的降低水平明顯高于其它基因型個體，因此388GG可增加他汀的藥效[13]。521C可降低OATP1B1與底物的親和力及轉運活性，減慢藥物代謝速率[14]，長期高劑量辛伐他汀會增加橫紋肌溶解癥的風險[15-17]。388A＞G、521T＞C兩個多態(tài)性位點可形成4種單倍型和9種不同表型。

位于人類19號染色體上ApoE基因的388T＞C、526C＞T基因多態(tài)性是機體脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)因子，也是影響他汀類降脂療效的主要因素，被認為是高脂血癥及動脈粥樣硬化性心腦血管病的候選易感基因。正常人群中Apoε2（388T?526T）攜帶者血漿TC、LDL?C水平低于Apoε3（388T?526C）型患者，他汀類藥物降脂效果相對其它2型最好。而Apoε4（388C?526C）型患者TC、LDL?C水平要遠高于Apoε3型，他汀類藥物的降脂療效往往不佳或無效，同時患冠心病、阿爾茲海默癥（Alzheimer′s disease，AD）和血管性癡呆（VD）的危險性也相對增加[18-19]。388T＞C，526C ＞T兩個基因多態(tài)性可產(chǎn)生3種基因亞型和6種不同表型。

華中地區(qū)漢族人群中SLCO1B1基因以*1a/*1b、*1b/*1b基因型為主，占71.79%，說明華中地區(qū)多數(shù)漢族人群可耐受大劑量他汀類藥物；APOE基因型中以ε3/ε3為主，占68.4%，說明華中地區(qū)多數(shù)漢族人群服用他汀類藥物相對安全，堅持服藥可以取得預期療效。不同性別SLCO1B1及APOE基因型分布與人群總體分布趨勢相同[12]。除SLCO1B1基因的*1a/*15亞型在男女性別中有差異外，其它均無差異?？梢娙A中地區(qū)漢族人群中他汀藥物的治療有較高的敏感性，中等強度他汀類藥物治療便可有效地將多數(shù)患者的LDL?C水平將至可接受范圍，因此不推薦華中地區(qū)患者大劑量、高強度使用他汀類藥[20]。

918例受檢者中發(fā)現(xiàn)同時具有APOE保護類基因型（ε2/ε2、ε2/ε3）和SLCO1B1正常代謝型（*1a/*1a、*1a/*1b、*1b/*1b）患者94例（10.24%），此類人群藥物劑量耐受能力強，發(fā)生SAS、冠心病、心梗、腦梗、老年癡呆等疾病的風險較低，療效好，是他汀類藥物的最佳受益人群。同時具有APOE風險類基因型（ε3/ε4、ε4/ε4）和 SLCO1B1弱代謝型（*5/*5、*5/*15、*15/*15）的患者1例（0.11%），該類人群藥物代謝能力較差，發(fā)生上述不良反應的風險較高，治療效果較差。該類人群應為他汀類藥物的禁用人群。

單獨具有APOE風險類基因型患者149例（16.23%），該類患者發(fā)生冠心病、心梗、腦梗、老年癡呆等患病風險較高，療效較差。有AD家族史或記憶力已經(jīng)明顯衰退的人群需進行ApoE基因多態(tài)性檢測，E4攜帶者的一級親屬（父母、子女以及同胞兄弟姐妹）均應進行ApoE基因多態(tài)性的檢測及遺傳咨詢，對于患者健康生活指導和合理化用藥都有重要意義，對高風險人群進行早期干預延緩AD的發(fā)生。單獨具有SLCO1B1弱代謝型患者11例（1.20%），該類患者需嚴格控制藥物使用劑量監(jiān)測藥物不良反應或考慮他汀類替代方案。由于患者長期服藥，為了達到最大療效和避免不良反應，篩查APOE風險類基因型及SLCO1B1弱代謝型，關注特殊人群對他汀藥物的反應，對臨床用藥指導及健康管理至關重要[13]。

SLCO1B1基因的388A＞G和521T＞C存在高度的連鎖不平衡，不同種族人群的分布存在很大差異。已有研究報道388A＞G在高加索人、非洲人和亞洲人中的突變頻率分別為30%～45%、70%～80%和60%～90%。521T＞C在高加索人、非洲人和亞洲人中的突變頻率分別為15%～20%，1%～2%和10%～15%[21]。本研究發(fā)現(xiàn)華中地區(qū)漢族人群中SLCO1B1 388A＞G和521T＞C的突變頻率分別為74.18%和10.95%，均在已報道的亞洲人的突變頻率范圍內(nèi)。本研究發(fā)現(xiàn)華中地區(qū)漢族人群中弱代謝型（*5/*5、*5/*15、*15/*15）患者占比1.20%（11/918），同華南及云南地區(qū)分布比例接近，這可能與華中地區(qū)以漢族人群為主，民族多樣性不強有關。可見華中地區(qū)漢族人群服用等量他汀藥物后血藥濃度低于其它種族人群，患肌病的風險性也相對更低。

因此，華中地區(qū)漢族人群的SLCO1B1 388A＞G和521T＞C基因突變具有自己的特點，臨床用藥時可根據(jù)這一特點適當調(diào)整給藥劑量。

由上可知，APOE、SLCO1B1基因多態(tài)性檢測對他汀類藥物的療效有重要聯(lián)系，不同的基因型其用藥風險不同，所使用的的藥物劑量也有較大差異；華中地區(qū)漢族人群大部分人群對他汀類藥物的敏感性較高（98.69%），只有極少數(shù)人群對他汀耐受性較差（1.31%），臨床需要提高警惕，尤其是人群中分布較少的SLCO1B1弱代謝型（*5/*5、*5/*15、*15/*15）及APOE風險類基因型（ε3/ε4、ε4/ε4）患者，加強臨床用藥指導及健康管理至關重要。

因此，檢測SLCO1B1與APOE基因多態(tài)性檢測對實現(xiàn)個體化治療具有重要意義，正在使用或考慮使用他汀類藥物進行治療的患者進行SL?CO1B1和ApoE基因多態(tài)性檢測，可實現(xiàn)個體化用藥和安全用藥。