王新敏 王小芳 盧洋 楊菩 韓玲 王英姿 張萬江 章樂

石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院1第一附屬醫(yī)院泌尿外科，2病理生理學(xué)教研室（新疆石河子 832002）

1 材料與方法

1.1 菌株、實驗動物和阻斷劑本研究所用菌株為結(jié)核分枝桿菌國際標(biāo)準(zhǔn)減毒株H37Ra，由中國藥物生物制品檢定所提供并保存。實驗所用小鼠為6～8周齡的SPF級（無特定病原體動物）健康雌性BALB/c小鼠，體質(zhì)量約（18±2）g，購買于石河子大學(xué)實驗動物中心。阻斷劑AG490、PD98059和LY294002購自于美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組將實驗小鼠分為H37Ra感染組、阻斷劑+H37Ra感染組（AG490+H37Ra感染組、PD98059+H37Ra感染組、LY294002+H37Ra感染組）和對照組，阻斷劑注射劑量為100 μg/只（實驗組前期篩選），同時設(shè)阻斷劑處理后的1、3、5、7 d 4個時間點，每組每個時間點各設(shè)10只小鼠，以阻斷劑處理時作為零時[5]。

1.2.2 構(gòu)建結(jié)核分枝桿菌感染小鼠模型在生物安全柜內(nèi)，用蘇通培養(yǎng)液與生理鹽水的混合物（0.5 mL；體積比為3∶1）稀釋細(xì)菌，取100 μL細(xì)菌稀釋液涂抹在改良羅氏培養(yǎng)基上。大約2～3周后，取生長狀態(tài)良好的菌落，加入少量含有0.05%Tween?80的生理鹽水，于磨菌器中充分研磨成均勻渾濁的菌懸液。將其濃度調(diào)整至1.0×107CFU/mL后，抽取0.3 mL腹腔注射到各組小鼠體內(nèi)[6]。在上述時間點將各阻斷劑經(jīng)腹腔注入各組小鼠體內(nèi)。

1.2.3 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的收集與提取于上述不同的時間點脫頸處死各組小鼠，將其處理至腹膜完全暴露后，向小鼠腹腔中注入5 mL RPMI?1640培養(yǎng)基，按摩腹部約10 min，反復(fù)抽吸數(shù)次（避開腸和脂肪），收集所有腹腔液。經(jīng)1 200 r/min離心5 min后，棄上清，PBS液洗滌1次，加入DMEM培養(yǎng)液（含10%胎牛血清）將細(xì)胞重懸。最終，將收集處理好的細(xì)胞接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，顯微鏡下觀察，貼壁細(xì)胞即為小鼠腹腔巨噬細(xì)胞[6]。

1.2.4 TUNEL技術(shù)檢測細(xì)胞凋亡在室溫下，將上述不同時間提取并培養(yǎng)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞固定于4%的多聚甲醛（pH 7.4）上，固定約15 min。PBS沖洗3次，每次5 min后，加入0.1%Triton X?100于冰上裂解細(xì)胞約8 min，PBS再次沖洗3次，每次5 min。按照TUNEL試劑盒說明書的步驟操作，凋亡的細(xì)胞被TUNEL反應(yīng)混合物標(biāo)記出來，TUNEL陽性細(xì)胞的數(shù)量通過顯微鏡觀察。

1.2.5 結(jié)核分枝桿菌菌落計數(shù)（CFU）將收集并提取的小鼠腹腔液經(jīng)6 000 r/min離心20 min，去上清后，加入1 mL 1%Triton X?100裂解液，約10 min后加入1 mL DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）終止裂解。將其振蕩混勻約5 min后，分別進(jìn)行10-2、10-3和10-4倍稀釋，最終接種于羅氏培養(yǎng)基上。每個稀釋濃度涂抹3個平板，分別置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，21 d后對其進(jìn)行菌落計數(shù)。

1.2.6 細(xì)胞免疫化學(xué)檢測Mcl?1的表達(dá)將上述各組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞制成細(xì)胞涂片，于4℃4%的多聚甲醛中過夜。PBS洗涂片兩次后，10%的胎牛血清中放置30 min，于4℃抗體孵育過夜。所用一抗為兔抗鼠 Mcl?1，濃度為 1∶1 000；二抗為PV6001山羊抗兔IgG/HRP聚合物，濃度為1∶200。最終，用蘇木素和伊紅（H&E）清洗和復(fù)染后，由2位病理學(xué)家對其進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析，Mcl?1表達(dá)的亞細(xì)胞位置（細(xì)胞核和胞質(zhì)）被記錄在400×放大的顯微鏡中，并用Mcl?1陽性巨噬細(xì)胞的百分比表示，標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[7]。

1.2.7 HE染色觀察小鼠臟器的變化在上述不同時間處死小鼠后，立即將其肺、肝、脾、腎取出，固定于10%的福爾馬林中，并用石蠟包埋。經(jīng)過95%乙醇和無水乙醇脫水處理后，用二甲苯處理約30 min。然后，石蠟包埋、切片、脫蠟處理后，梯度脫水5 min。最后，通過蘇木精和伊紅著色，于顯微鏡下觀察和評估每個圖像中存在的炎癥水平，炎癥區(qū)會比非炎癥區(qū)染得更濃，從而觀察到細(xì)胞或組織的組成和病變。

第二階段為依賴階段，企業(yè)己建立較完整的安全條件和紀(jì)律約束，員工需要遵守安全規(guī)范要求，安全管理不只是安全管理人員的職責(zé)，其它員工也有義務(wù)參與。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法所得實驗數(shù)據(jù)均通過SPSS 17.0統(tǒng)計軟件處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差描述。當(dāng)數(shù)據(jù)資料滿足正態(tài)分布時，使用單因素方差分析（ANOVA），應(yīng)用SNK?q檢驗進(jìn)行多個樣本均數(shù)間的兩兩比較；對于計數(shù)資料或計量資料不服從正態(tài)性且方差不齊時采用非參數(shù)檢驗，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 阻斷Mcl?1表達(dá)信號通路促進(jìn)了小鼠腹腔巨噬細(xì)胞凋亡應(yīng)用阻斷劑AG490、PD98059、LY294002阻斷Mcl?1表達(dá)后，TUNEL技術(shù)檢測了小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的凋亡率。結(jié)果顯示，與對照組相比，H37Ra感染組的凋亡率顯著增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表1）。阻斷劑AG490、PD98059、LY294002作用于H37Ra感染的小鼠后，小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的凋亡率均呈現(xiàn)不同程度的升高，其中阻斷劑PD98059處理組的凋亡率顯著高于AG490和LY294002處理組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖1A）。

2.2 PD98059處理減少了巨噬細(xì)胞內(nèi)結(jié)核桿菌的數(shù)量考慮到阻斷劑誘導(dǎo)凋亡的效果，檢測了阻斷劑PD98059處理后小鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)H37Ra的數(shù)量。菌落計數(shù)結(jié)果顯示，與未處理的H37Ra感染組相比，阻斷劑PD98059處理的H37Ra感染組小鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)H37Ra的菌落數(shù)量顯著減少（P＜0.05，圖1B），約減少了57.5%（從4.0× 107減少到1.7× 107）。

表1 抑制劑處理的H37Ra感染的小鼠巨噬細(xì)胞中Mcl?1的表達(dá)和凋亡率Tab.1 The expression of Mcl?1 and macrophages apoptosis rate in mice infected with H37Ra treated with inhibitors

圖1 阻斷劑處理對H37Ra感染的小鼠巨噬細(xì)胞凋亡和胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌的影響Fig.1 Effect of inhibitors on apoptosis of macrophages and intracellular MTB in mice infected with H37Ra

2.3 阻斷劑PD98059處理抑制了Mcl?1的表達(dá)細(xì)胞免疫化學(xué)檢測了不同信號通路阻斷劑處理對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中Mcl?1表達(dá)的影響。數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，Mcl?1在H37Ra感染組的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中呈現(xiàn)陽性表達(dá)（表1）。用阻斷劑AG490、LY294002處理的H37Ra感染的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中Mcl?1的表達(dá)受到輕微抑制，而阻斷劑PD98059處理組Mcl?1的表達(dá)受到明顯抑制。與H37Ra感染組相比，在阻斷劑PD98059處理的H37Ra感染組的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中，Mcl?1的表達(dá)被顯著抑制，其陽性細(xì)胞只有20%（P＜ 0.05，表1）。

2.4 Mcl?1信號通路抑制劑處理減輕了結(jié)核感染的小鼠臟器的病理損傷

2.4.1 H37Ra感染組小鼠臟器變化與對照組相比，H37Ra感染組肺臟呈現(xiàn)肺毛細(xì)血管和間質(zhì)大部分區(qū)擴(kuò)張淤血，散在小灶肺間質(zhì)內(nèi)淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤；肝臟呈現(xiàn)中央靜脈淤血，匯管區(qū)灶性淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤；脾臟呈現(xiàn)脾紅髓明顯擴(kuò)張、淤血、出血；腎臟呈現(xiàn)腎間質(zhì)部分區(qū)血管擴(kuò)張、淤血（圖2）。

2.4.2 阻斷劑處理的H37Ra感染組臟器變化與對照組相比，阻斷劑AG490和LY294002處理減輕了肺臟毛細(xì)血管和間質(zhì)部分區(qū)、肝臟中央靜脈、脾臟脾紅髓及腎臟腎間質(zhì)部分區(qū)的擴(kuò)張淤血程度，而且減少了肝臟匯管區(qū)灶性炎性細(xì)胞的浸潤（圖2）。阻斷劑PD98059處理明顯減輕了肺臟肺毛細(xì)血管和間質(zhì)、肝臟中央靜脈、脾臟脾紅髓、腎臟腎間質(zhì)血管的淤血程度，而且脾臟的出血明顯減輕（圖2）。

3 討論

巨噬細(xì)胞對抗結(jié)核感染的主要宿主細(xì)胞，可通過壞死、凋亡和自噬發(fā)揮免疫防御機(jī)制，影響感染的結(jié)局，而凋亡為主的死亡降低了不同真菌和細(xì)菌（包括結(jié)核分枝桿菌）的生存能力[8-10]。在結(jié)核感染期間，巨噬細(xì)胞中有多個分子及其相關(guān)信號通路參與了宿主細(xì)胞凋亡的調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，Mcl?1在結(jié)核分枝桿菌感染的宿主巨噬細(xì)胞凋亡的調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用[4-5，11]。

圖2 阻斷劑處理的H37Ra感染的小鼠臟器的免疫組織變化Fig.2 Immunohistochemical changes of mice infected with H37Ra treated with inhibitors

目前，Mcl?1的表達(dá)主要是通過激活Janus激酶/信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化（janus kinase/signal trans?ducer and activator of transcription，JAK/STAT）信號通路、磷脂酰肌醇激活（phosphatidylinositol 3?ki?nase，PI?3K）信號通路、促分裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）信號通路來發(fā)揮作用[5-6]。JAK/STAT信號通路包括多種生物反應(yīng)，如細(xì)胞增殖、凋亡和免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)[12]。大量的實驗證實AG490可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，對正常細(xì)胞幾乎沒有副作用[13-14]。MAPK通路是MAPK/ERK通路的細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶[15]。PI?3K信號通路主要通過影響下游的各種效應(yīng)分子，發(fā)揮抗凋亡作用[16]。當(dāng)PI?3K信號通路抑制劑LY294002應(yīng)用于人類巨噬細(xì)胞后，Mcl?1的表達(dá)水平顯著降低[17]。而根據(jù)實驗前期研究結(jié)果[4]，本實驗僅分析了阻斷劑處理后第5天Mcl?1干預(yù)對小鼠的影響。實驗結(jié)果證實，3條信號通路阻斷劑阻斷Mcl?1表達(dá)后均能誘導(dǎo)H37Ra感染的小鼠巨噬細(xì)胞凋亡，其中以MAPK信號通路阻斷劑PD98059處理組誘導(dǎo)凋亡效果最好（圖1）。此實驗結(jié)果證實，阻斷Mcl?1的表達(dá)信號通路確實能夠有效增加結(jié)核感染的宿主巨噬細(xì)胞凋亡。然而，對于Mcl?1信號通路阻斷劑對于結(jié)核潛伏感染的消除作用還有待進(jìn)一步論證。

課題組前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MAPK信號通路阻斷劑PD98059比PI?3K和JAK/STAT途徑阻斷劑誘導(dǎo)更多的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞凋亡，且Mc?1蛋白表達(dá)明顯下降[11]，因此，筆者推測MAPK信號通路是調(diào)控Mcl?1表達(dá)的主要通路。細(xì)胞免疫化學(xué)結(jié)果證實了筆者的推測，MAPK信號通路抑制劑PD98059處理H37Ra的小鼠巨噬細(xì)胞后，不僅Mcl?1的表達(dá)受到明顯抑制（表1），而且宿主巨噬細(xì)胞內(nèi)的菌落數(shù)量顯著降低（圖1）。除此之外，阻斷劑PD98059與阻斷劑AG490和LY294002相比，可明顯減輕小鼠肺臟、肝臟、脾臟和腎臟各臟器的壞死程度，使病變程度得到改善（圖2）。毫無疑問，這些結(jié)果很直觀地證實，通過阻斷Mcl?1表達(dá)的信號通路可有效消除結(jié)核桿菌的潛伏感染，而MAPK信號通路是其主要調(diào)控通路。

MAPK家族是細(xì)胞信號傳導(dǎo)的重要樞紐，一系列的生物因子（如生長因子、淋巴因子、腫瘤促進(jìn)因子及應(yīng)激因子等）均可通過膜受體直接激活MAPK通路，從而調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、代謝、凋亡等。而PI?3K信號通路的活化主要是通過RAS?RAF?MEK?ERK通路，間接調(diào)控細(xì)胞凋亡[18]。JAK/STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路阻斷劑AG490是通過阻斷多種細(xì)胞因子引起的JAK2/STAT3的磷酸化激活，繼而阻斷JAK/STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑。結(jié)核感染可使JAK2/STAT1?α磷酸化，從而誘導(dǎo)生成大量TNF?α[19]，導(dǎo)致Caspase酶系活性增強(qiáng)，從而啟動細(xì)胞凋亡。然而，Caspases酶系可以分解 Mcl?1導(dǎo)致Mcl?1的水平上調(diào)。MAPK信號通路阻斷Mcl?1表達(dá)時，可通過p38 MAPK和ERK兩個分支拮抗TNF?α降低引起 Mcl?1 上調(diào)[5]。因此，當(dāng)分別應(yīng)用阻斷劑AG490、PD98059和 LY294002阻斷 Mcl?1的表達(dá)時，PD98059處理組作用最顯著。由此可知，利用Mcl?1干預(yù)在結(jié)核潛伏感染中的特殊作用，有針對性的開發(fā)相應(yīng)的藥物或疫苗，必將加快人類戰(zhàn)勝結(jié)核的腳步。

綜上所述，阻斷Mcl?1表達(dá)的信號通路可以顯著促進(jìn)結(jié)核感染的小鼠巨噬細(xì)胞的凋亡，減少結(jié)核桿菌在宿主巨噬細(xì)胞內(nèi)的潛伏，減輕結(jié)核感染對小鼠臟器的病理損傷。而MAPK信號通路是此過程中的主要調(diào)控通路，PD98059為其特異性抑制劑。此研究從形態(tài)學(xué)角度分析了Mcl?1干預(yù)對結(jié)核感染的巨噬細(xì)胞的調(diào)控作用，不僅為當(dāng)前耐多藥結(jié)核病藥物的研發(fā)提供了更多的思路和方向，還為Mcl?1干預(yù)應(yīng)用于結(jié)核的預(yù)防與控制提供了更多的理論依據(jù)。然而，對于MAPK信號通路的詳細(xì)調(diào)控機(jī)制在本研究中并未涉及，這也將是下一步的研究方向。