周露 唐廣勝 朱竑翊

1南京醫(yī)科大學(xué)康達(dá)學(xué)院（江蘇連云港222000）；2南京醫(yī)科大學(xué)（南京210029）

目前，缺血性心臟病，如心肌梗死，在全世界范圍內(nèi)有很高的發(fā)病率和病死率。臨床上，最快速有效的治療方法就是及時恢復(fù)缺血區(qū)域的血供，而恢復(fù)血供會進(jìn)一步引起心肌損傷，具體表現(xiàn)為心肌細(xì)胞死亡、心律失常、心臟功能障礙，最終導(dǎo)致心臟衰竭，引起嚴(yán)重后果，這種由缺血后恢復(fù)血供（即再灌注）引起的損傷，稱為缺血再灌注（ischaemia/reperfusion，l/R）損傷[1-2]。但是，目前尚未有有效的治療手段來對抗I/R損傷。2003年，ZHAO等[3]提出了缺血后適應(yīng)（ischemic postcondi?tioning，IPostC）的概念，即在缺血組織得到再灌注之前采取短暫重復(fù)缺血、灌注處理，可以明顯緩解氧化應(yīng)激、抑制心肌細(xì)胞凋亡、降低梗死面積，從而對抗I/R損傷發(fā)揮心臟保護(hù)作用。然而，IPostC因其作用機制不清而在臨床使用中受限。Hippo信號通路是新發(fā)現(xiàn)的，高度保守的生長控制信號通路，可以通過抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡調(diào)控器官發(fā)育和大小[4-5]。近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)Hippo信號通路在心臟發(fā)育、生長、再生甚至心血管疾病形成過程中發(fā)揮了重要作用[6-8]。既然Hippo信號通路參與心肌細(xì)胞增殖、凋亡過程，那么是否也參與了IPostC的心臟保護(hù)作用呢？至今尚未見報道。本實驗將以Hippo信號通路中的核心分子，如MST（Mam?malian Sterile20?like Kinase）、YAP（Yes?associated protein）為研究對象，探討該通路是否參與IPostC及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物出生1～3 d SD大鼠，購自購自南京醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，動物合格證號：SCXK（蘇）2002?0031。

1.1.2 主要試劑DMEM（high glucose）、胎牛血清（美國Hyclone）；MTT、二甲基亞砜（美國Amresco公司）；MDA試劑盒、BCA蛋白濃度檢測試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)研究所）；Protein A/G PLUS?Agrose（美國Santa Cruz公司）；抗Bcl?xL抗體、抗Bax抗體、抗MST1抗體（美國BD Biosciences）；抗GAPDH 抗體、抗 p?MST1/2（Thr183/180）抗體、抗YAP抗體、抗p?YAP（Ser127）抗體（美國Cell Signal?ing）；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔、羊抗鼠IgG（巴傲得生物科技有限公司）；LipofectamineTM2000（美國Life technologies）。

1.2 方法

1.2.1 乳鼠心肌細(xì)胞分離及培養(yǎng)取1～3 d的新生SD大鼠，酒精消毒后，用眼科剪取出心臟置于盛有預(yù)冷D?Hanks緩沖液的表面皿中，待洗凈剪除其他組織后，轉(zhuǎn)移到錐形瓶中，用手術(shù)剪將其剪成盡量小的組織塊。使用胰酶分離乳鼠心肌細(xì)胞，然后采用Percoll梯度離心法提純心肌細(xì)胞[9]。乳鼠心肌細(xì)胞使用含有10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2、95%濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞模型建立缺氧/復(fù)氧（H/R）細(xì)胞模型以及缺氧后適應(yīng)（HPostC）模型按照之前的方法建立[10]。缺氧/復(fù)氧組細(xì)胞缺氧環(huán)境中培養(yǎng)3 h，正常氧環(huán)境繼續(xù)培養(yǎng)6 h；缺氧后適應(yīng)組細(xì)胞缺氧培養(yǎng)3 h后，正常氧環(huán)境繼續(xù)培養(yǎng)5 min，然后迅速缺氧培養(yǎng)5 min，如此反復(fù)3次，將細(xì)胞置于CO2培養(yǎng)箱中正常氧環(huán)境繼續(xù)培養(yǎng)6 h。

1.2.3 Si?RNA細(xì)胞轉(zhuǎn)染取對數(shù)生長期細(xì)胞，離心后重懸于不含抗生素的細(xì)胞培養(yǎng)基中，以1×105/孔接種于6孔板中，細(xì)胞生長至融合率90%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。按說明書步驟使用LipofectamineTM2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染。MST1?siRNA和陰性對照siRNA（NC?siRNA）由上海吉瑪設(shè)計合成。MST1?siRNA正義序列：5′?CACTACAATATGAGCAGCAGCCAT?GGTT?3′，反義序列：5′?CCATGGCTGCTCATATTG?TAGTGTT?3′；NC?siRNA 正義序列：5′?CACAC?TATAAGCGGACCTAGATGTT?3′，反義序列：CATC?TAGGTCCGCTTATAGTGTGTT?3′。

1.2.4 細(xì)胞凋亡檢測細(xì)胞模型建立后，將乳鼠心肌細(xì)胞消化、離心，PBS洗滌后，按照AnnexinV?FITC凋亡試劑盒的步驟進(jìn)行操作，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡測定。

1.2.5 細(xì)胞活性檢測使用四甲基偶氮唑鹽比色法（MTT）檢測。取對數(shù)生長期細(xì)胞接種到96孔板中，細(xì)胞貼壁后進(jìn)行造模。每孔加入20 μL MTT液，37℃孵育4 h后，吸取上清液，每孔加入二甲基亞砜100 μL以終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在570 nm波長處檢測吸光度。

1.2.6 丙二醛（MDA）含量檢測乳鼠心肌細(xì)胞造模后，消化離心得到細(xì)胞沉淀，使用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，1 600g離心10 min，取上清使用碧云天MDA試劑盒進(jìn)行測定。

1.2.7 免疫共沉淀（CO?IP）造模完成的細(xì)胞消化離心后，提取蛋白并使用BCA蛋白濃度檢測試劑盒測定蛋白濃度，最終將各組蛋白濃度調(diào)整一致。加入要沉淀的目的蛋白抗體，4℃旋轉(zhuǎn)過夜后加入40 μL瓊脂糖珠，4℃旋轉(zhuǎn)2 h后，離心棄上清，保留含免疫復(fù)合物的珠子。加緩沖液反復(fù)洗瓊脂糖珠4次，加SDS上樣緩沖液，混勻加熱后進(jìn)行SDS?PAGE電泳。

1.2.8 蛋白免疫印跡（western blot）造模完成的細(xì)胞消化離心后，提取蛋白質(zhì)并使用BCA蛋白濃度檢測試劑盒測定蛋白濃度。加SDS上樣緩沖液，混勻加熱后取50 μg蛋白上樣，進(jìn)行SDS?PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，依次加入一抗、二抗，加發(fā)光液后在顯影儀上顯影，使用ImageJ軟件對條帶進(jìn)行灰度分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法利用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行資料分析，各組計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Tukey檢驗，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hippo信號通路參與HPostC保護(hù)作用通過檢測細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞活力、細(xì)胞MDA含量等指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)染MST1?siRNA細(xì)胞和轉(zhuǎn)染NC?siRNA細(xì)胞中，H/R均明顯增加了細(xì)胞凋亡率、降低了細(xì)胞活力，增加了MDA含量，而后適應(yīng)能夠削弱H/R所誘導(dǎo)的這些細(xì)胞損傷作用（表1、圖1）。此外，通過計算（HPostC?H/R）/H/R表示轉(zhuǎn)染不同siRNA細(xì)胞中HPostC保護(hù)作用的程度。如表1所示，轉(zhuǎn)染了MST1?siRNA的細(xì)胞，在細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞活力、細(xì)胞MDA含量中，其（HPostC?H/R）/H/R值均明顯低于轉(zhuǎn)染了陰性對照NC?siRNA的，說明MST1基因沉默使得HPostC的心肌保護(hù)作用減弱，因此，Hippo信號通路參與了HPostC的心肌保護(hù)作用。

表1 不同處理組的細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞活力及細(xì)胞MDA含量（n=5）Tab.1 Apoptotic rate、survival rate and MDA level in cardiomyocytes with different treatment±s

表1 不同處理組的細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞活力及細(xì)胞MDA含量（n=5）Tab.1 Apoptotic rate、survival rate and MDA level in cardiomyocytes with different treatment±s

注：H/R-缺氧/復(fù)氧處理組、HPost-缺氧后適應(yīng)處理組；&P ＜ 0.05 vs.Control；*P ＜ 0.05 vs.H/R；#P ＜ 0.05 vs.（HPostC?H/R）/H/R in NS?siRNA cells

凋亡率（%）細(xì)胞活力（%）MDA[nmol/（L·mg protein）]NS?siRNA Control H/R HPostC（HPostC?H/R）/H/R（%）MST1?siRNA Control H/R HPostC（HPostC?H/R）/H/R（%）1.98±0.14 40.12±3.33&5.37±2.10*82.13±3.02 2.23±0.08 20.59±3.41&8.48±1.89*54.96±1.52#100 50.38±7.31&79.77±6.56*61.53±6.69 2.67±0.55 11.23±2.52&5.89±0.57*53.11±9.43 100 68.18±5.42&78.46±8.79 22.32±4.42#2.31±0.31 6.48±1.52&4.23±1.62 32.06±6.44#

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測不同處理方式對乳鼠心肌細(xì)胞凋亡率的影響（n=5）Fig.1 Apoptotic rate in neonatal rat cardiomyocytes with different treatment using the flow?cytometer

2.2 HPostC影響MST1、YAP磷酸化水平 為了探討Hippo信號通路參與HPostC的機制，通過蛋白免疫印跡實驗檢測了Hippo信號通路中的關(guān)鍵組分MST、YAP的蛋白表達(dá)水平以及其磷酸化水平。結(jié)果表明，H/R以及HPostC對MST1、YAP的蛋白表達(dá)水平?jīng)]有明顯影響，但對MST、YAP的磷酸化水平均有明顯影響。如圖2所示，與Control組相比，H/R組MST、YAP的磷酸化水平均明顯提高，而與H/R組相比，HPostC組MST、YAP的磷酸化水平均明顯降低。

圖2 MST1和YAP的蛋白表達(dá)水平和磷酸化水平（n=3）Fig.2 The expression and phosphorylation of MST1 and YAP

2.3 HPostC影響MST與Bcl?xL之間的相互作用采用免疫共沉淀法檢測MST與Bcl?xL、Bcl?xL與Bax間的相互作用。結(jié)果顯示，H/R組MST與Bcl?xL間相互作用明顯增強，而HPostC明顯減弱了相互作用；H/R組Bcl?xL與Bax間相互作用明顯減弱，HPostC組卻使相互作用得到了部分恢復(fù)（圖3）。說明HPostC通過影響MST與凋亡相關(guān)蛋白Bcl?xL間的作用，進(jìn)而影響B(tài)cl?xL與Bax間相互作用，最終抑制心肌細(xì)胞凋亡。

3 討論

IPostC 的心臟保護(hù)作用已經(jīng)明確[3，11-12]，但是其作用機制復(fù)雜，影響因素眾多，所以確切的機制還在進(jìn)一步的完善之中。目前，比較公認(rèn)的作用機制是IPostC可以通過激活再灌注損傷補救激酶（reperfusion injury survival kinase，RISK）信號通路來發(fā)揮保護(hù)作用[13-14]。本實驗采用乳鼠心肌心肌細(xì)胞建立缺氧后適應(yīng)模型，結(jié)果顯示后適應(yīng)顯著降低細(xì)胞凋亡率，增強細(xì)胞活性，降低氧化損傷，具有心肌細(xì)胞保護(hù)作用，這一結(jié)果與此前研究及其他研究者的結(jié)果一致[10-11]，說明后適應(yīng)心肌細(xì)胞模型建立成功。在后適應(yīng)模型建立成功的基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步探討后適應(yīng)保護(hù)作用的機制。

Hippo信號通路是由一系列蛋白激酶及轉(zhuǎn)錄共激活因子所組成的激酶鏈，可以通過抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡調(diào)控器官發(fā)育和大小[4-5]。哺乳動物的Hippo信號通路主要由3部分組成：（1）上游信號分子，NF2、Fat、FRMD等；（2）核心激酶級聯(lián)反應(yīng)鏈，MST、WW45、LATS、YAP等；（3）下游調(diào)節(jié)因子，TEAD、RASSF等[4]。其中，MST和YAP是這條通路中的核心成分，也是近年來的研究熱點。Hippo信號通路從發(fā)現(xiàn)至今，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展方面研究較多[15-16]，而在心臟方面的研究較少。近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)Hippo信號通路在心臟發(fā)育、生長、再生甚至心血管疾病形成過程中均發(fā)揮了重要作用，其中就包括了缺血再灌注損傷的形成以及心肌梗死[6，8]。MATSUDA等[6]的研究發(fā)現(xiàn)在I/R的小鼠心臟中，MST和YAP的磷酸化水平顯著升高，這與本研究的實驗結(jié)果一致。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)后適應(yīng)可以降低MST和YAP的磷酸化水平。同時，本研究轉(zhuǎn)染了MST1?siRNA使MST1基因沉默，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染了MST1?siRNA的細(xì)胞中，后適應(yīng)處理的保護(hù)作用明顯弱于轉(zhuǎn)染了陰性對照NC?siRNA細(xì)胞的，也就是說MST基因沉默后后適應(yīng)的保護(hù)作用被部分取消了，這就說明Hippo信號通路參與了后適應(yīng)的保護(hù)作用。

Hippo信號通路調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖凋亡的機制還未完全闡明，根據(jù)近年的研究，明確的機制主要有兩種：（1）MST與其上游信號分子WW45相互作用，發(fā)生磷酸化被激活后，使下游LATS1/2?Mob復(fù)合物磷酸化并活化，進(jìn)而使YAP磷酸化，p?YAP被阻斷在胞漿中，從而限制了YAP進(jìn)入細(xì)胞核促進(jìn)細(xì)胞增殖和對抗細(xì)胞凋亡的功能[6，17]；（2）MST通過與Bcl?xL 相互作用，使Bcl?xL磷酸化，磷酸化位點是新穎的Ser14，p?Bcl?xL與Bax分離，從而抑制Bcl?xL 活性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[7，18]。本研究發(fā)現(xiàn)，I/R激活MST，使MST磷酸化水平增加，活化的MST再經(jīng)過下游信號分子的作用，使YAP磷酸化水平增加，p?YAP被滯留在胞漿中，無法進(jìn)入細(xì)胞核刺激相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，從而抑制細(xì)胞增殖促進(jìn)細(xì)胞凋亡。而后適應(yīng)可以降低MST磷酸化水平，降低MST活性，進(jìn)而降低YAP磷酸化水平，使更多的YAP進(jìn)入細(xì)胞核，發(fā)揮促增殖抗凋亡的作用，這也是后適應(yīng)保護(hù)心肌細(xì)胞對抗I/R損傷的機制之一。為了進(jìn)一步研究Hippo信號通路參與后適應(yīng)的機制，本研究采用CO?IP方法檢測了MST與Bcl?xL以及Bcl?xL與Bax之間的相互作用。本研究發(fā)現(xiàn)I/R可以增強MST與Bcl?xL之間相互作用，即增加Bcl?xL磷酸化水平，促進(jìn)Bcl?xL與Bax解離，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，這與其他研究者的研究結(jié)果是一致的[7，17]。而后適應(yīng)削弱了I/R促進(jìn)MST使Bcl?xL磷酸化的作用，因而發(fā)揮對抗細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用，這說明后適應(yīng)可以通過削弱MST與Bcl?xL之間相互作用來發(fā)揮保護(hù)作用。

綜上所述，Hippo信號通路參與了后適應(yīng)的心肌保護(hù)作用，其機制是：（1）降低MST磷酸化水平，從而降低YAP磷酸化水平，促進(jìn)YAP進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)對抗細(xì)胞凋亡；（2）削弱MST與Bcl?xL之間相互作用，抑制Bcl?xL與Bax解離，抑制細(xì)胞凋亡。我們將建立在體缺血/再灌注模型，從整體動物水平進(jìn)一步探討Hippo信號通路在缺血后適應(yīng)中的作用及其機制，并深入探索Hippo信號通路中其他成分的作用。