胡臘 馮笑 陳紀(jì)濤 劉兆宇 翁錦生 李曉媚 曾子成 劉季芳

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院（廣州 510700）

人類(lèi)白細(xì)胞抗原（human leucocyte antigen，HLA）幾乎在所有有核細(xì)胞中表達(dá)，主要在細(xì)胞間相互識(shí)別、抗原提呈及免疫應(yīng)答中具有重要作用。HLA?I除了參與腫瘤細(xì)胞的免疫監(jiān)視及免疫逃避外，對(duì)由T細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤治療也有嚴(yán)重影響[1]。有文獻(xiàn)報(bào)道[2]HLA?I在人體多種腫瘤組織中均表達(dá)降低，促進(jìn)癌細(xì)胞逃避T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫監(jiān)視；此外HLA?I表達(dá)降低會(huì)抑制細(xì)胞毒性免疫機(jī)制的激活，進(jìn)而影響以T細(xì)胞活化為基礎(chǔ)的腫瘤治療效果[3]。

流行病學(xué)研究表明，二甲雙胍能夠降低2型糖尿病患者患癌癥的風(fēng)險(xiǎn)[4]。在非免疫缺陷型的白血病老鼠模型中，二甲雙胍能夠增加CD8+腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞（TILs）的數(shù)量，并保護(hù)細(xì)胞免于衰竭和凋亡，進(jìn)而發(fā)揮其免疫介導(dǎo)的抗腫瘤效應(yīng)[5]。此外，二甲雙胍可通過(guò)激活A(yù)MPK途徑而殺死結(jié)腸癌[6]、骨髓瘤和乳腺癌的癌細(xì)胞。

研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍可通過(guò)改變?nèi)橄侔┘?xì)胞的能量代謝，增加乳腺癌細(xì)胞表面HLA?I的水平，進(jìn)而降低腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體免疫監(jiān)視的能力[7]。那么，二甲雙胍是否可通過(guò)影響肝癌細(xì)胞中HLA?I及其亞型的表達(dá)進(jìn)而發(fā)揮其免疫介導(dǎo)的抗肝癌效應(yīng)？目前尚未有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，因此本文就這一科學(xué)問(wèn)題展開(kāi)研究，主要通過(guò)觀察不同濃度的二甲雙胍對(duì)肝癌細(xì)胞中HLA?I類(lèi)分子（HLA?E、HLA?A2402和β2?M）的影響，初步探討二甲雙胍抗肝癌的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株人肝癌細(xì)胞株HepG2購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，細(xì)胞使用RPMI1640培養(yǎng)基（內(nèi)含10%胎牛血清），在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.1.2 試劑二甲雙胍購(gòu)自德國(guó)Sigma?Aldrich；Human HLA class I PE?conjugated Antibody購(gòu)買(mǎi)自R&D Systems公司；磁珠購(gòu)自BD公司；Trizol購(gòu)自Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT?PCR試劑盒購(gòu)自Takara；RPMI1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清及PBS購(gòu)自美國(guó)Glibco公司。

1.1.3 主要儀器流式細(xì)胞儀（BD FACSCantoⅡTM）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（ABI7500）；雙模塊PCR儀（伯樂(lè)S100048/48雙模）；多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTEK）；倒置熒光顯微鏡（萊卡DMi8）；恒溫水浴鍋（德國(guó)Thermo Scientific）；水平層流超凈工作臺(tái)（德國(guó)Thermo Scientific Hohen）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)將培養(yǎng)基、血清、胰酶、PBS、培養(yǎng)皿等物品放入超凈臺(tái)中并打開(kāi)紫外燈滅菌30 min；預(yù)先打開(kāi)水浴鍋開(kāi)關(guān)并設(shè)置溫度為37℃，待水浴鍋溫度升至37℃后將細(xì)胞從液氮罐中取出后迅速在水浴鍋中不斷搖晃至凍存液完全融化，然后將其轉(zhuǎn)移至加有8 mL培養(yǎng)基（RPMI 1640+10%FBS）的培養(yǎng)皿中，并吹打混勻，然后將細(xì)胞置于37℃、5%CO2的恒溫恒濕箱中培養(yǎng)，定時(shí)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行換液和傳代。

1.2.2 藥物處理取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，用PBS洗滌細(xì)胞兩遍，用0.25%的胰酶充分消化細(xì)胞后，用含血清的培養(yǎng)基終止消化并吹打混勻后均勻接種于兩塊六孔板中，放入37℃、5%CO2的恒濕箱中培養(yǎng)過(guò)夜，次日上午對(duì)照組中加入0 mmol/L二甲雙胍的不含胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組中分別加入含0.5、1、2、5、10 mmol/L二甲雙胍的無(wú)血清的RPMI1640培養(yǎng)基，同時(shí)另外兩孔中加入25、50 ng/mL的干擾素（interferon，IFNγ）作為陽(yáng)性對(duì)照，將處理后的細(xì)胞放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要做相應(yīng)處理。

1.2.3 流式樣本制備（1）細(xì)胞準(zhǔn)備：①取預(yù)先處理好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的六孔板細(xì)胞，用PBS洗兩次后每孔加入100 μL胰酶進(jìn)行消化；②待消化充分后加入2 mL培養(yǎng)基終止消化并吹散混勻，將吹散好的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到15 mL離心管中做好標(biāo)記并離心（300 g/5 min）；③棄去上清，加入一定量PBS洗滌后離心（300 g/5 min），再棄去上清，加入0.5 mL PBS后將細(xì)胞輕輕混勻。（2）染色上機(jī)：①?gòu)纳鲜鲭x心管中各取50 μL的細(xì)胞于相應(yīng)流式管中并標(biāo)注為處理組，向各流式管中加入對(duì)應(yīng)的熒光素標(biāo)記抗體HLA?ABC抗體（每種5 μL（抗體及細(xì)胞比例為1∶10）后混勻），室溫避光孵育25 min（孵育過(guò)程中再混勻一次）；②從上述離心管中各取50 μL的細(xì)胞于相應(yīng)流式管中并標(biāo)注為對(duì)照組，對(duì)照組不加染料（抗體）；③除了上述兩大組（處理組和對(duì)照組）樣本外，尚有2管用來(lái)調(diào)補(bǔ)償?shù)臉颖荆杭?xì)胞量同上50 μL，向其中一管加入HLA?ABC抗體，第2管內(nèi)只有細(xì)胞；④染色完成后加入1 mL的PBS洗滌細(xì)胞，離心 300 g/5 min；⑤棄去上清，加入 600 μL PBS重懸、混勻細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)。

1.2.4 Real?time PCR檢測(cè)用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下反轉(zhuǎn)錄為cDNA。目的基因β2?M、HLA?E和HLA?A2402及內(nèi)參GAPDH的引物見(jiàn)表1，實(shí)時(shí)熒光定量PCR在7500 Software v2.3儀器上進(jìn)行。根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR中Ct值計(jì)算出△Ct值，采用相對(duì)定量2-△Ct法比較目的基因mRNA的表達(dá)差異，PCR中每個(gè)樣本均重復(fù)3次，取其平均值。

表1 所檢測(cè)目的基因及其引物序列Tab.1 The detected target genes and its primer sequence

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以表示，兩組間比較采用方差分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 二甲雙胍對(duì)HepG2細(xì)胞內(nèi)HLA?I mRNA表達(dá)水平的影響HepG2細(xì)胞經(jīng)不同濃度二甲雙胍或IFNγ（陽(yáng)性對(duì)照）刺激24 h后，RT?PCR 檢測(cè) β2?M、HLA?E、HLA?A2402表達(dá)水平，與對(duì)照組（0 mmol/L）相比，0.5、2、5、10 mmol/L二甲雙胍處理均能提高肝癌細(xì)胞HepG2中β2?M、HLA?E、HLA?A2402 mRNA表達(dá)水平，且5和10 mmol/L二甲雙胍處理后，β2?M mRNA表達(dá)水平分別提高了2和2.6倍（圖1）；HLA?E mRNA表達(dá)水平分別提高了1.8和2倍（圖2）；HLA?A2420 mRNA表達(dá)水平分別提高了1.6和1.9倍（圖3），且上述變化差異均有顯著性（P＜0.01），表明二甲雙胍處理能提高肝癌細(xì)胞HepG2中HLA?I mRNA的水平。

圖1 RT?PCR檢測(cè)二甲雙胍及干擾素處理后HepG2中β2?M的表達(dá)情況Fig.1 Expression of β2?M mRNA in HepG2cell line treated by metformin and interferon

圖2 二甲雙胍及干擾素處理后HLA?E表達(dá)水平的變化Fig.2 Changes of HLA?I mRNA levels in HepG2cells treated with metformin and interferon

2.2 二甲雙胍對(duì)HepG2細(xì)胞膜表面HLA?I蛋白表達(dá)的影響經(jīng)不同濃度二甲雙胍或干擾素處理HepG2細(xì)胞24 h后，按照規(guī)范的實(shí)驗(yàn)方法制作樣本進(jìn)行流式上機(jī)檢測(cè)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組（0 mmol/L）相比，實(shí)驗(yàn)組不同濃度二甲雙胍（0.5～10 mmol/L）并不影響細(xì)胞膜表面HLA?I的情況（P＞0.05，圖4）。

圖4 二甲雙胍處理后HepG2細(xì)胞表面HLA?I水平變化Fig.4 The effect of metformin on HLA?I on the surface of HepG2cells

3 討論

2005年1份流行病學(xué)報(bào)告顯示，服用二甲雙胍的糖尿病患者腫瘤發(fā)病率明顯低于服用其他降糖藥物的患者[8]。近年來(lái)大量研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍對(duì)患有肝癌、大腸癌、胰腺癌、胃癌及食管癌的糖尿病患者具有保護(hù)作用[9]。2013年來(lái)二甲雙胍與腫瘤的臨床試驗(yàn)也相繼展開(kāi)。文獻(xiàn)報(bào)道[10]，二甲雙胍有望能夠改善乳腺癌的繼發(fā)性?xún)?nèi)分泌耐藥；二甲雙胍能夠通過(guò)LKB1?AMPK?mTOR通路抑制腫瘤的生長(zhǎng)[11]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍可顯著降低肝癌細(xì)胞線(xiàn)粒體的活性[12]，且二甲雙胍能夠通過(guò)激活A(yù)MPK誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞衰老[13]，二甲雙胍與 5?FU 聯(lián)合應(yīng)用對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞具有協(xié)同抑制作用[14]。此外有研究發(fā)現(xiàn)[5]二甲雙胍能夠通過(guò)增加CD8+腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞（TILs）的數(shù)量，保護(hù)細(xì)胞免于衰竭和凋亡，進(jìn)而發(fā)揮其免疫介導(dǎo)的抗腫瘤效應(yīng)。這些研究都表明二甲雙胍具有抗腫瘤的作用，其可能成為一種新的治療腫瘤的手段，但目前對(duì)二甲雙胍抗腫瘤的具體機(jī)制尚不完全明確。

有研究表明，在人體黑色素瘤中，HLA?I水平越低，其體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞的致瘤性更強(qiáng)，體外實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞的增殖率、轉(zhuǎn)移能力及侵襲力更高[15]。HLA?I的下調(diào)會(huì)減弱肺癌免疫治療的臨床效果[16]，此外HLA?I的下降和缺失會(huì)與腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移有關(guān)，且HLA?I的水平越低，疾病的預(yù)后越差。但與正常細(xì)胞相比，癌細(xì)胞表面HLA?I水平明顯降低，嚴(yán)重影響癌癥患者免疫治療的效果，這也成為癌細(xì)胞逃避免疫細(xì)胞攻擊和清除的重要誘因。而在黑色素瘤中通過(guò)轉(zhuǎn)染HLA?A2使HLA?I水平升高，可以逆轉(zhuǎn)由 HLA?I降低引起的高致瘤性[15]。可見(jiàn)通過(guò)逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞表面HLA?I表達(dá)水平，對(duì)尋找腫瘤治療的新靶點(diǎn)及新方法具有重要意義。

本研究首次著眼于探索二甲雙胍對(duì)HLA?I所介導(dǎo)的免疫機(jī)制對(duì)肝癌的影響，研究中發(fā)現(xiàn)，5和10 mmol/L二甲雙胍可以顯著提高β2?M、HLA?E、HLA?A2402 mRNA水平，可見(jiàn)二甲雙胍能夠在轉(zhuǎn)錄水平影響HLA?I表達(dá)。雖然流式結(jié)果表明，二甲雙胍對(duì)細(xì)胞表面經(jīng)典的HLA?I蛋白表達(dá)無(wú)明顯影響，但HLA?I的功能是與抗原結(jié)合后，將抗原遞呈給腫瘤反應(yīng)性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，因此當(dāng)環(huán)境中缺少抗原時(shí)，HLA的功能不能正常發(fā)揮，無(wú)法在細(xì)胞膜上檢測(cè)到HLA?I的明顯變化。且HLA?I的功能不僅受蛋白表達(dá)水平影響，也受抗原加工遞呈（antigen?processing machinery，APM）分子的影響[15]，所以二甲雙胍除了調(diào)節(jié)HLA部分亞型的mRNA表達(dá)水平外，也可能通過(guò)APM分子間接影響MHC?I的抗原遞呈功能，從而提高腫瘤細(xì)胞的抗原性和免疫原性，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞免疫監(jiān)視。此外，二甲雙胍在轉(zhuǎn)錄水平上顯著提高HLA?I輕鏈及部分重鏈分子的水平，卻未在蛋白水平檢測(cè)到類(lèi)似的改變，推測(cè)HLA?I可能受到翻譯及翻譯后修飾的調(diào)節(jié)。

本研究的實(shí)驗(yàn)環(huán)境中缺乏抗原，這也可能是僅有部分亞型的HLA發(fā)生顯著變化的原因，因此，為了更深入研究二甲雙胍對(duì)肝癌細(xì)胞中HLA?I轉(zhuǎn)錄、翻譯、翻譯后修飾及功能的影響，筆者擬用有效濃度的二甲雙胍處理肝癌HepG2細(xì)胞，再用抗原肽刺激該細(xì)胞，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞表面抗原肽的表達(dá)水平等進(jìn)一步探討二甲雙胍抗肝癌的免疫學(xué)機(jī)制。