王楊文潔 劉肇杰 安惠暄 張纓

北京體育大學(xué)運動人體科學(xué)學(xué)院（北京100084）

運動引起肌肉收縮產(chǎn)生具有生物活性的物質(zhì)——肌肉因子，是調(diào)控骨骼肌能量代謝的重要因素[1]。Ape?lin作為近年來新發(fā)現(xiàn)的肌肉因子[2]，被認(rèn)為可能參與了運動調(diào)控骨骼肌能量代謝的作用。

Apelin的前體是包含77個氨基酸的多肽原，可被剪切為多種具有生物活性的片段，這些片段均含有apelin-13的氨基酸序列，因此apelin-13被認(rèn)為是ape?lin的基本結(jié)構(gòu)[3-5]。已有研究報道，apelin-13 C末端的苯丙氨酸（phenylalanine，Phe）被丙氨酸（alanine，Ala）所替代，形成異構(gòu)體apelin-13（F13A），被認(rèn)為是ape?lin-13的拮抗劑[6，7]。而另有研究報道，苯丙氨酸缺失的apelin片段仍具有結(jié)合和活化apelin受體的功能[8-11]，故F13A被認(rèn)為是apelin-13的類似物，與apelin-13的作用相同。因此，F(xiàn)13A的具體作用還需進(jìn)一步證實。

Apelin作為細(xì)胞膜上G蛋白偶聯(lián)受體APJ的內(nèi)源性配體，廣泛表達(dá)于中樞系統(tǒng)和外周組織（如心臟、肺、腎臟、脂肪組織和骨骼肌等）中[10]。Apelin可通過內(nèi)分泌、旁分泌和自分泌的方式作用于APJ，進(jìn)而參與調(diào)節(jié)心血管功能[12]、體液平衡[13]等，而在能量代謝（特別是骨骼?。┓矫娴淖饔弥钡浇陙聿攀艿疥P(guān)注。已有研究表明，apelin與細(xì)胞膜上的APJ結(jié)合后，可上調(diào)骨骼肌腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）的磷酸化水平和過氧化體增殖活化受體γ輔助活化因子（peroxisome proliferator-activated receptor γ co?activator-1α，PGC-1α）的蛋白表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控骨骼肌能量代謝[14-16]。解偶聯(lián)蛋白（uncoupling proteins，UCPs）是分布于線粒體內(nèi)膜上的一類產(chǎn)熱蛋白，可介導(dǎo)線粒體呼吸鏈的代謝物脫氫氧化和ADP磷酸化過程解偶聯(lián)，使產(chǎn)生的能量以熱能的形式釋放，其中解偶聯(lián)蛋白3（uncoupling proteins 3，UCP3）是主要在骨骼肌中表達(dá)的解偶聯(lián)蛋白，是哺乳動物體溫的重要調(diào)控因子[17，18]。另外，UCP3還可促進(jìn)脂肪酸氧化，并對體重、體脂和靜息代謝率等產(chǎn)生影響[19-21]。也有文獻(xiàn)報道，骨骼肌UCP3的表達(dá)可能受AMPK、PGC-1α的調(diào)控[22-25]。目前雖然已有研究表明有氧運動可增加骨骼肌apelin/APJ的表達(dá)[26]，但有氧運動介導(dǎo)apelin是否對骨骼肌UCP3的表達(dá)產(chǎn)生影響及其可能的調(diào)節(jié)通路并不清楚。

本研究采用C57BL/6J雄性小鼠為研究對象，通過4周有氧運動并腹腔注射生理鹽水或F13A，觀察小鼠骨骼肌apelin、APJ、AMPK、p-AMPK、PGC-1α及UCP3蛋白表達(dá)和能量代謝相關(guān)指標(biāo)的變化，探討4周有氧運動介導(dǎo)apelin對小鼠骨骼肌UCP3表達(dá)的影響及可能的機(jī)制，觀察F13A在本研究中的具體作用。

1 材料與方法

1.1 研究對象與分組

SPF級健康4周齡的C57BL/6J雄性小鼠（購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，其實驗動物許可證:SCXK（京）2015-0001）40只，于北京體育大學(xué)動物飼養(yǎng)房（飼養(yǎng)許可證編號:SYXK（京）2011-0034）中分籠飼養(yǎng)，每籠5只。動物飼養(yǎng)房室溫控制在20～25℃，相對濕度50%～70%，12︰12 h晝夜循環(huán)照明（光照時間7:00～19:00），國家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動物常規(guī)飼料飼養(yǎng)，自由進(jìn)食和飲水。

適應(yīng)性喂養(yǎng)4周后，8周齡小鼠體重22.55±4.08 g，按體重隨機(jī)分為生理鹽水組（Saline，S）和F13A組（F13A，F(xiàn)），每組20只；各組再隨機(jī)分為安靜組（Con?trol，C）和運動組（Exercise，E），分別為生理鹽水安靜組（SC）、生理鹽水運動組（SE）、F13A安靜組（FC）、F13A運動組（FE），每組10只。

1.2 干預(yù)方案

F13A組小鼠通過腹腔注射F13A（瑞士Bachem公司;H-7752）0.2μmol/kg/day[6，20]；Saline組小鼠以同樣的方式注射300μl生理鹽水作為對照。注射時間為每天15:00，持續(xù)28天。

安靜組小鼠正?；\中活動，不施加任何運動負(fù)荷。

正式實驗前3天，運動組小鼠分別進(jìn)行10 min、20 min、40 min的適應(yīng)性跑臺訓(xùn)練，方案為：坡度5°，速度15 m/min。正式實驗為跑臺有氧運動，前2周坡度為5°，速度15 m/min（約70%～75%最大攝氧量強(qiáng)度），60 min/天，6天/周；2周訓(xùn)練后，采用實驗動物監(jiān)測系統(tǒng)（美國Columbus Instruments）對小鼠進(jìn)行最大攝氧量的測量，根據(jù)測量結(jié)果，調(diào)整后2周的訓(xùn)練方案為坡度5°，速度20 m/min（約70%～75%最大攝氧量強(qiáng)度），60 min/天，6天/周。跑臺訓(xùn)練共持續(xù)4周。

1.3 取材

最后一次運動后48 h，進(jìn)行摘眼球取血，在內(nèi)壁涂有EDTA的抗凝管中靜置30 min，后轉(zhuǎn)速3000 rpm，離心15 min，分離出的血漿凍存在-20℃?zhèn)溆?；取血后立即脫頸處死，迅速取兩側(cè)小腿三頭肌，稱量，用錫紙包裹標(biāo)記，投入液氮，后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱，保存待用。

1.4 指標(biāo)測定

1.4.1 攝食量、體重監(jiān)控

每天14:00定時稱量籠中飼料量，計算每組每天平均攝食量。分別稱量4周干預(yù)前后小鼠的體重，并計算干預(yù)前后體重的變化量。

1.4.2 WesternBlot測定骨骼肌apelin、APJ、AMPK α、p-AMPK α（Thr172）、PGC- 1 α、UCP 3的蛋白表達(dá)

100 mg骨骼肌加入800μl含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液（碧云天），剪碎，超速勻漿；冰盒中靜置30 min，隨后轉(zhuǎn)速12000 rpm、4℃離心30 min，取上清液，將提取的總蛋白置于－20℃，保存待用。

采用BCA法對總蛋白濃度進(jìn)行測定（BCA Protein Assay Reagent，美國Thermo Scientific公司）。根據(jù)測定的總蛋白濃度，以上樣量20μg/次，計算總蛋白上樣量，進(jìn)行配樣。采用Blot 4%～12%Bis-Tris Plus凝膠（美國life technologies公司）和NuPAGE MES SDS（1×）電泳緩沖液（美國life technologies公司）進(jìn)行電泳，后用iBlot Gel Transfer System（美國Invitrogen公司）將電泳后蛋白從電泳凝膠轉(zhuǎn)移至NC膜上。標(biāo)記目的條帶后用5%的脫脂牛奶或BSA封閉1 h。用相應(yīng)的一抗在4℃孵育過夜，一抗的稀釋比例依次是：1︰500的apelin（美國Santa Cruz Biotechnology，sc-293441）、1︰2000 的 APJ（美國Santa Cruz Biotechnology，sc-33823）、1︰1000的AMPKα（美國Santa Cruz Biotechnology，sc-74461）、1︰1000的p-AMPKα（美國Santa Cruz Biotechnology，sc-33524）、1︰500的 PGC-1α（美國 Santa Cruz Biotechnology，sc-13067）、1︰2000 的 UCP3（美國Santa Cruz Biotechnolo?gy，sc-31387）和1︰1000的總蛋白內(nèi)參β-Tubulin（Pro?teintech Group，10094-1-AP）。

次日用1×TBST洗脫，10 min/次，共3次。洗脫后用相應(yīng)的二抗在室溫下孵育1 h，二抗的稀釋比例分別是：1︰1000的apelin（羊抗小鼠，中科晨宇，164018）、1︰1000的APJ（羊抗兔，中杉金橋，ZB-2301）、1︰5000的AMPKα（羊抗小鼠，中科晨宇，164018）、1︰2000的p-AMPKα（羊抗兔，中杉金橋，ZB-2301）、1︰1000的PGC-1α（羊抗兔，中杉金橋，ZB-2301）、1︰4000的UCP3（兔抗羊，中科晨宇，164036）和1︰5000的β-Tu?bulin（羊抗兔，中杉金橋，ZB-2301）。之后用1×TBST洗脫，10 min/次，共3次。加入發(fā)光液顯影，放入Bio-Rad凝膠成像儀曝光，拍照。使用Image Lab軟件對條帶進(jìn)行檢測分析，讀取積分灰度值。計算公式如下：

1.4.3 測定血漿總apelin含量

小鼠血漿樣本置于冰上備用，采用apelin酶聯(lián)免疫試劑盒（美國Sigma公司；RAB00181KT）測定血漿總apelin的含量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計處理，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。在方差齊性的條件下，采用雙因素方差分析對藥物和運動因素的主效應(yīng)以及兩因素的交互作用進(jìn)行統(tǒng)計分析。若兩因素有交互作用（P＜0.05），則采用LSD法進(jìn)行簡單效應(yīng)檢驗；若兩因素?zé)o交互作用，同一因素內(nèi)采用獨立樣本t檢驗。顯著性水平以P＜0.05表示具有顯著性差異；P＜0.01表示非常顯著性差異。

2 研究結(jié)果

2.1 攝食量和體重變化

如圖1所示，F(xiàn)C組與SC組相比，小鼠攝食量無顯著性變化。SE組與SC組相比，攝食量呈增加趨勢，但沒有顯著性差異。而FE組與FC組相比，除了第20天之外，攝食量在其余時間均顯著性增加（P＜0.05或0.01）。如圖2所示，F(xiàn)C組與SC組相比，小鼠體重?zé)o顯著性差異；SE和FE組分別與其Control組相比，小鼠體重均呈下降的趨勢，但無顯著差異。

圖1 平均攝食量的變化

圖2 體重的變化

2.2 骨骼肌蛋白表達(dá)的變化

2.2.1 Apelin蛋白表達(dá)

如圖3所示，與SC組相比，F(xiàn)C組和SE組小鼠骨骼肌apelin蛋白表達(dá)均顯著性增加（P＜0.05）；FE組與FC組相比，骨骼肌apelin蛋白表達(dá)非常顯著性增加（P＜0.01）。

圖3 骨骼肌apelin蛋白表達(dá)的變化

2.2.2 APJ蛋白表達(dá)

如圖4所示，F(xiàn)C組與SC組相比，骨骼肌APJ蛋白表達(dá)無顯著性差異。SE組與其Control組相比，APJ蛋白表達(dá)呈增加趨勢，但無顯著性差異。而FE組與FC組相比，APJ蛋白表達(dá)非常顯著性增加（P＜0.01）。

2.2.3 AMPK α、p-AMPK α（Thr172）蛋白表達(dá)及p-AMPK α（Thr172）/AMPK α 比值

如圖5所示，SE組與其Control組相比，骨骼肌p-AMPKα（Thr172）蛋白表達(dá)顯著性增加（P＜0.05）；同時，F(xiàn)E組與其Control組相比，骨骼肌p-AMPKα（Thr172）蛋白表達(dá)和p-AMPKα（Thr172）/AMPKα比值呈現(xiàn)顯著性增加（P＜0.01，P＜0.05）。

圖5 骨骼肌AMPKα、p-AMPKα（Thr172）蛋白表達(dá)及p-AMPKα（Thr172）/AMPKα比值的變化

2.2.4 PGC- 1 α蛋白表達(dá)

如圖6所示，F(xiàn)E組與FC組相比，PGC-1α蛋白表達(dá)顯著性增加（P＜0.05）。

圖6 骨骼肌PGC-1α蛋白表達(dá)的變化

2.2.5 UCP 3蛋白表達(dá)

如圖7所示，F(xiàn)E組與FC組相比，UCP3蛋白表達(dá)顯著性增加（P＜0.05）。

圖7 骨骼肌UCP3蛋白表達(dá)的變化

2.3 血漿中總apelin含量

如圖8所示，F(xiàn)E組與FC組相比，血漿apelin濃度顯著性降低（P＜0.05）。

圖8 血漿apelin含量的變化

3 討論

3.1 F13 A與有氧運動對小鼠骨骼肌apelin、APJ、AMPK α、p-AMPK α（Thr172）、PGC- 1 α和UCP 3 蛋白表達(dá)的影響

APJ作為apelin機(jī)體內(nèi)的天然配體，在apelin轉(zhuǎn)基因小鼠股四頭肌中APJ mRNA表達(dá)顯著性增加[27]。對胰島素抵抗小鼠4周腹腔注射apelin-13，比目魚肌中的p-AMPKα/AMPKα比值顯著升高，并顯著上調(diào)PGC-1α mRNA的表達(dá)[6]。另有研究表明，C2C12細(xì)胞中轉(zhuǎn)染PGC-1α，可通過線粒體代謝產(chǎn)生ROS，上調(diào)UCP3 mRNA表達(dá)[28]。因此，由上述實驗推測，apelin的干預(yù)可促進(jìn)骨骼肌中apelin/APJ表達(dá)，進(jìn)而激活A(yù)MPK—PGC-1α信號通路，增強(qiáng)UCP3的表達(dá)以調(diào)節(jié)骨骼肌能量代謝。在本研究中，單純注射F13A后僅小鼠小腿三頭肌apelin的蛋白表達(dá)顯著性增加，而APJ、p-AMPKα（Thr172）/AMPKα、PGC-1α及UCP3的表達(dá)均無顯著性變化。分析其原因可能是由于:1）F13A生物活性可能低于apelin。Yang等[11]通過對apelin結(jié)構(gòu)的研究提出，F(xiàn)13A雖具有與apelin-13相同的結(jié)合與激活apelin受體—APJ的生物學(xué)作用，但其生物活性弱于apelin-13；2）本實驗采用的是小腿三頭肌，而F13A可能對不同骨骼肌肌纖維類型的作用不同。

運動刺激骨骼肌收縮可產(chǎn)生并分泌apelin[2]。AMPK作為細(xì)胞代謝的能量感受器，大鼠在一次性跑臺運動后3小時股四頭肌AMPKα磷酸化水平顯著升高，并上調(diào)PGC-1α的mRNA和蛋白表達(dá)[29]。另有研究采用電刺激模擬運動刺激，干預(yù)體外培養(yǎng)的大鼠骨骼肌細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)骨骼肌中AMPKα磷酸化水平、PGC-1α蛋白表達(dá)及UCP3 mRNA表達(dá)顯著性升高[30]。高脂飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗大鼠進(jìn)行8周跑臺運動后，可顯著增加比目魚肌和腓腸肌中apelin、APJ mRNA和蛋白表達(dá)量[26]。那么，運動訓(xùn)練是否可通過apelin/APJ—AMPK—PGC-1α，促進(jìn)骨骼肌UCP3蛋白表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)骨骼肌能量代謝？在本研究中，單純4周有氧運動后小鼠小腿三頭肌apelin的蛋白表達(dá)顯著性增加，而APJ、p-AMPKα（Thr172）、PGC-1α及UCP3表達(dá)雖有增加趨勢，但無顯著性差異。推測可能與4周的有氧運動時間不足有關(guān)，仍有待于進(jìn)一步確定。雖然單純F13A或有氧運動干預(yù)，小鼠骨骼肌這些蛋白表達(dá)均無顯著性差異，然而，注射F13A并進(jìn)行有氧運動組骨骼肌 apelin、APJ、p-AMPKα（Thr172）、PGC-1α 及UCP3蛋白表達(dá)均顯著性增加。提示有氧運動可增強(qiáng)機(jī)體對F13A干預(yù)的敏感性，促進(jìn)F13A介導(dǎo)骨骼肌apelin/APJ—AMPK—PGC-1α信號通路，提高UCP3的表達(dá)，增強(qiáng)骨骼肌能量代謝調(diào)節(jié)。

3.2 F13 A與有氧運動對小鼠攝食量和體重的影響

在下丘腦外側(cè)區(qū)apelin/APJ的高表達(dá)可能提示apelin在食欲調(diào)節(jié)中的重要作用[31，32]。對小鼠第三腦室連續(xù)10天注射apelin-13（1μg/day），可促進(jìn)小鼠攝食量（第3-7天）的顯著性增加[33]。連續(xù)14天腹腔注射不同劑量（1、5和50μg/kg）apelin-13后，發(fā)現(xiàn)大鼠攝食量呈現(xiàn)劑量依賴性增長[32]。也有研究發(fā)現(xiàn)，apelin轉(zhuǎn)基因鼠與野生型小鼠相比，無論高脂飲食或正常飲食其攝食量并無顯著性變化。以上實驗結(jié)果的不同可能與實驗對象、apelin的干預(yù)方式不同有關(guān)，其具體作用并不明確。在本研究中，單純F13A干預(yù)對小鼠攝食量并無顯著性影響，但F13A結(jié)合運動后，小鼠攝食量呈現(xiàn)顯著性增加。表明4周有氧運動可擴(kuò)大F13A對小鼠攝食量的調(diào)控作用，并推測這一攝食調(diào)控作用可能與上述骨骼肌apelin等蛋白表達(dá)增加有關(guān)。

UCP3作為骨骼肌脂質(zhì)代謝重要的調(diào)節(jié)因子，對體重變化有一定影響。UCP3基因敲除鼠骨骼肌中線粒體的脂肪酸氧化能力降低[21]。也有文獻(xiàn)表明，apelin-13（0.1μg/kg/day）干預(yù)后可增加骨骼肌UCP3 mRNA表達(dá)，降低正常飲食和高脂飲食小鼠的體重和脂肪含量，而小鼠攝食量沒有顯著性變化[20]。但Tekin等[32]研究結(jié)果與上相反，SD雄性大鼠連續(xù)14天腹腔注射1、5、50μg/kg/day不同劑量apelin-13后，骨骼肌UCP3 mRNA表達(dá)均顯著性降低，而大鼠體重則顯著性升高。以上實驗結(jié)果表明，apelin-13干預(yù)后骨骼肌UCP3表達(dá)與體重可出現(xiàn)成反比例的關(guān)系。在本研究中，單純F13A干預(yù)對骨骼肌UCP3表達(dá)和小鼠體重均無顯著性影響；在F13A結(jié)合運動的FE組，與FC組相比雖然小鼠骨骼肌UCP3蛋白表達(dá)出現(xiàn)顯著性增加，但小鼠體重僅有降低的趨勢，也無顯著性差異。此結(jié)果是否與該組小鼠的攝食量顯著性增加有關(guān)，仍需要進(jìn)一步確定。在本研究中若增加測定骨骼肌組織脂代謝相關(guān)指標(biāo)，可能會有更好地解釋說明骨骼肌UCP3與脂代謝或體重的關(guān)系。

3.3 F13 A與有氧運動對小鼠血漿apelin含量的影響。

在本研究中，F(xiàn)E組與FC組相比，小鼠血漿apelin水平顯著降低，與骨骼肌apelin蛋白表達(dá)的結(jié)果相反。推測運動對apelin表達(dá)的影響在不同組織中可能不同。Yang等[26]研究顯示高脂飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗大鼠進(jìn)行8周跑臺運動后，骨骼肌apelin和APJ表達(dá)增加，而脂肪組織和血漿中apelin、APJ水平顯著降低。此FE組小鼠血漿apelin水平的顯著降低可能與其脂肪組織apelin的表達(dá)水平相一致[34]。

4 結(jié)論

本實驗中，F(xiàn)13A保留著結(jié)合與激活A(yù)PJ受體的生物活性，是APJ受體的激動劑。4周有氧運動結(jié)合腹腔注射F13A，可促進(jìn)骨骼肌apelin/APJ表達(dá)，激活A(yù)MPK—PGC-1α信號通路，進(jìn)而提高UCP3蛋白表達(dá)。