王 洲，王 權(quán)，劉美劍

(江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇泰州225000)

精子超低溫冷凍保存技術(shù)能夠長期保持種質(zhì)資源、保證水產(chǎn)動物遺傳物質(zhì)的多樣性。該技術(shù)已在多種魚類精子保存中得到應(yīng)用［1］，然而有關(guān)鳑鲏精子超低溫冷凍保存技術(shù)研究較少［2］，中華鳑鲏精子冷凍保存技術(shù)方面還未有報道。本研究根據(jù)中華鳑鲏與日本鳑鲏生物學(xué)相近，參考日本鳑鲏精子超低溫冷凍保存方法，選取在魚類中運(yùn)用比較廣泛的二甲基亞砜作為冷凍保護(hù)劑［3］，探討了3種不同濃度的DMSO、在不同的冷凍高度、特定高度下不同的保持時間對解凍后精子活力的影響。旨在篩選出一種可以用于中華鳑鲏精子冷凍保存方案，同時為后期進(jìn)一步優(yōu)化冷凍保存方案、長期保存中華鳑鲏優(yōu)良種質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 鳑鲏與精子的收集 2016年4—5月從江蘇泰州姜堰獲得性成熟的中華鳑鲏個體，置于實(shí)驗(yàn)室水族箱(55 cm×30 cm×40 cm)內(nèi)暫養(yǎng)1周。其間充氧并保持微流水，同時投喂優(yōu)質(zhì)飼料對鳑鲏進(jìn)行營養(yǎng)強(qiáng)化，水溫為18～20℃。取達(dá)到性成熟的鳑鲏個體［4－5］，采精時先用干毛巾將鳑鲏魚擦干后，用指尖輕輕按壓鳑鲏腹部，精液從生殖孔中流出，將精液收集到玻璃培養(yǎng)皿中。取少量精液用生理鹽水(5%)激活后在顯微鏡下鏡檢，收集活力超過90%的精液樣本。將來自不同親本的3個精液樣本混合，室溫設(shè)定為20℃。

1.1.2 抗凍保護(hù)劑與人工精漿 二甲基亞砜(DMSO)具有快速滲透細(xì)胞膜的作用，作為冷凍保護(hù)劑已經(jīng)在多種魚類精子研究被證實(shí)具有較好的效果［6］。本研究選取3種不同的濃度(5%、10%、15%)的DMSO用于試驗(yàn)研究。為避免抗凍保護(hù)劑添加過程中對精子活力的潛在影響，精液在冷凍前一步加入到人工精漿(ASP)［2］－二甲基亞砜(DMSO)混合液中。ASP－DMSO混合液的配制按表1，試劑配好后用蒸餾水定容至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH值至8.0。所有試劑均為現(xiàn)用現(xiàn)配，室溫存放時間不超過2 h。

表1 ASP－DMSO混合液配方

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 精子激活后活力受時間的影響 為評估精子在水中存活時間，首先對精子動性進(jìn)行評估，制定精子活力隨時間延長的變化圖。取收集好的精液0.1 mL，加2.0 mL生理鹽水(5%)激活，顯微鏡下對精子動性進(jìn)行觀察，用血球計數(shù)板記錄精子數(shù)，統(tǒng)計活力。

1.2.2 精子冷凍 將取自3個不同鳑鲏個體的精液收集好后混合，取0.1 mL精液與2.0 mL ASP－DMSO混合液混合，混合完成后移入0.5 mL的麥管(IMV，法國)，將麥管置于泡沫板上平放，后轉(zhuǎn)入含有液氮的泡沫箱中保持?jǐn)?shù)分鐘，最終轉(zhuǎn)入液氮中。泡沫板呈階梯狀，階梯水平面距離液氮表面距離不同用以控制冷凍速率的快慢。為篩選出較優(yōu)的鳑鲏冷凍保存方法，本研究對不同冷凍高度、液氮液面上不同保持時間進(jìn)行篩選，以篩選出較優(yōu)的冷凍方法。

1.2.2.1 不同冷凍高度對精子解凍后活力的影響 基于已發(fā)表的日本鳑鲏精子冷凍保存的研究［7］，本研究選取精子在加入ASP－DMSO混合液之后在液氮表面上方保持5 min，后轉(zhuǎn)入液氮中。本試驗(yàn)設(shè)置了4種冷凍高度(麥管置于階梯泡沫上水平放置，距離液氮表面高度分別為5、7、9、11 cm)，以設(shè)置不同梯度冷凍速率。

1.2.2.2 精液在液氮液面上保持不同時間的影響 根據(jù)以上試驗(yàn)結(jié)果，選取液氮液面以上5 cm作為精子冷凍高度，同時設(shè)置液氮液面上4種不同保持時間(4、5、6、7 min)，用以篩選出較優(yōu)的保持時間。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，選取液氮液面上方5 cm，每隔10 s記錄該高度時的溫度(Fluke，美國)，繪制溫度－時間變化曲線圖(圖1)，用以給出試驗(yàn)時溫度參數(shù)。

1.2.3 精子解凍 麥管在投入液氮中保存2 h后，用鑷子小心地取出，立即置于20℃水中解凍20 s。取解凍后的混合液0.1 mL，用2.0 mL生理鹽水稀釋。后用血球計數(shù)板對解凍后精子活力進(jìn)行計數(shù)，統(tǒng)計活力。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示;數(shù)據(jù)分析使用SPSS23.0進(jìn)行單因素方差分析;繪圖使用Excel 2010軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 精子激活后活力受時間的影響

由圖1可知，鳑鲏精子激活后動性在所選取各個時間節(jié)點(diǎn)處明顯下降;精子在5 min內(nèi)能保持較高的活力，5 min后活力明顯下降，10 min后只有少量精子能存活，未發(fā)現(xiàn)有超過13 min的精子。

2.2 不同冷凍高度對精子解凍后活力的影響

由表2可知，液氮液面上方5 cm處冷凍后解凍精子效果較高，其中10%DMSO冷凍后解凍精子動性最高，15%DMSO次之，5%DMSO在此條件下未發(fā)現(xiàn)有解凍后精子游動的現(xiàn)象;其余高度在不同濃度DMSO中冷凍后解凍精子均未發(fā)現(xiàn)具有動性。

表2 精子在不同液面高度保持5 min后轉(zhuǎn)入液氮冷凍后解凍精子活力

2.3 液氮液面上保持不同時間冷凍對解凍后精子活力的影響

由圖3可知，液氮上方5 cm保持5 min時冷凍后解凍精子能夠獲得較高的動性，高于其他幾組(4、6、7 min);5%DMSO保持4 min后冷凍后解凍觀察到少量精子活動(3.19%)，10%DMSO在保持7 min后冷凍解凍后精子動性較低(1.15%)，其余多數(shù)在振動，未發(fā)現(xiàn)游動精子(圖中橫坐標(biāo)上加粗部分表示解凍后精子動性為零試驗(yàn)組)。

3 討論

精液超低溫冷凍保存關(guān)鍵在于用一定濃度的抗凍保護(hù)劑充分滲透入精子內(nèi)部、使之快速脫水;同時，盡量減少抗凍保護(hù)劑毒性對精子的影響。該試驗(yàn)中，中華鳑鲏在激活后精子保持較高動性(82.25%)時間相對較短(＜5 min)?？紤]到后期抗凍保護(hù)劑在加入后DMSO的毒性問題，本試驗(yàn)在收集好精液后直接和ASP－DMSO混合物混合，以防止DMSO在逐步加入過程中局部濃度過大對精子造成損傷;同時減少精子暴露在抗凍保護(hù)劑中時間從而降低其毒性。

有別于部分魚類精子玻璃化冷凍保存方案，該試驗(yàn)采用低速慢凍保存技術(shù)。有研究認(rèn)為，精子冷凍保存在降溫時細(xì)胞內(nèi)外在成冰過程中有冷凍損傷、細(xì)胞質(zhì)變化、細(xì)胞骨架等影響［8－10］，影響精子解凍活力。慢速冷凍有助于緩解冷凍過程中胞內(nèi)外滲透壓急劇變化帶來的生理生化影響，從而提高解凍精子存活率。本試驗(yàn)在液氮上方5 cm保持5 min，該條件下冷凍速度為19～－75℃/min，后轉(zhuǎn)入液氮，解凍精子動性高于其他組，該趨勢與日本鳑鲏中的超低溫冷凍結(jié)果相似(20 ～ －80 ℃ /min)［7］。

該試驗(yàn)方法可用于中華鳑鲏基因超低溫冷凍保存，為進(jìn)一步提高解凍后動性率，還須對抗凍保護(hù)劑毒性、冷凍速率、解凍方法進(jìn)行優(yōu)化。