劉洋， 林曉晨， 李鴻鈞

(1. 昆明醫(yī)科大學(xué)， 昆明 650500； 2. 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所， 云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 昆明 650118)

在全球范圍內(nèi)經(jīng)研究證實(shí),輪狀病毒為5歲以下兒童發(fā)生嚴(yán)重感染性腹瀉的常見病毒，因此由輪狀病毒感染引發(fā)的疾病受到關(guān)注。

輪狀病毒是由11個雙鏈RNA片段通過有序的拆卸和組裝三層結(jié)構(gòu)的二十面體來進(jìn)行管理和復(fù)制(見圖1)?；蚱?負(fù)責(zé)結(jié)構(gòu)蛋白VP1、基因片段2負(fù)責(zé)結(jié)構(gòu)蛋白VP2、基因片段3負(fù)責(zé)結(jié)構(gòu)蛋白VP3、基因片段4負(fù)責(zé)結(jié)構(gòu)蛋白VP4、基因片段5負(fù)責(zé)非結(jié)構(gòu)蛋白NSP1、基因片段6負(fù)責(zé)結(jié)構(gòu)蛋白VP6、基因片段7負(fù)責(zé)非結(jié)構(gòu)蛋白NSP2、基因片段8負(fù)責(zé)非結(jié)構(gòu)蛋白NSP3、基因片段9負(fù)責(zé)結(jié)構(gòu)蛋白VP7、基因片段10負(fù)責(zé)非結(jié)構(gòu)蛋白NSP4、基因片段11負(fù)責(zé)非結(jié)構(gòu)蛋白NSP5和非結(jié)構(gòu)蛋白NSP6[1-2]。VP1蛋白是在組裝病毒RNA時必需的聚合酶；VP2蛋白是將VP1及VP3蛋白裝配其內(nèi)部的基質(zhì)蛋白；VP4蛋白是由VP5蛋白和VP8蛋白組成的結(jié)合蛋白，以及形成雙層顆粒結(jié)構(gòu)，進(jìn)而可以合成病毒mRNA的組抗原蛋白VP6；VP7是同VP4共同組成最外層衣殼結(jié)構(gòu)的外殼糖蛋白[3]。NSP1的作用方式是通過對干擾素調(diào)節(jié)因子(IRF)的影響，進(jìn)而發(fā)揮作用；通過判定NSP2在機(jī)體內(nèi)的抗體水平，進(jìn)而判斷是否再度感染輪狀病毒；NSP3的作用需進(jìn)一步研究；NSP4通過對細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)的影響作用，進(jìn)而在細(xì)胞形態(tài)、致病機(jī)制中都發(fā)揮重要作用；NSP5在病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄中是不可缺少的重要因素。

圖1 輪狀病毒結(jié)構(gòu)[4]

1 輪狀病毒NSP5的結(jié)構(gòu)相關(guān)研究

Martin等[5]通過多角度激光散射、沉降速度和平衡沉降實(shí)驗(yàn)揭示了NSP5具有兩個低聚區(qū)域，第一個區(qū)域殘基103～146，參與NSP5二聚化；而第二區(qū)域殘基189～198，負(fù)責(zé)NSP5十聚體，通過分析十聚體區(qū)域主要是螺旋的，而二聚區(qū)域涉及β-折疊，進(jìn)一步研究顯示NSP5包含兩α-螺旋，無序的N-末端和C-末端是主要由β-折疊層組成。研究中還發(fā)現(xiàn)，NSP5片段和NSP2在未感染細(xì)胞中的共表達(dá)NSP5十聚體區(qū)域是形成類病毒所必需的結(jié)構(gòu)。然而，在體外，NSP5的區(qū)域部分抑制NSP2-NSP5相互作用，研究中的NSP5模型表明該空間位阻阻止NSP2與所有NSP5的結(jié)合。NSP5是一種富含蘇氨酸且絲氨酸被高度磷酸化的高酸性蛋白。NSP5還是一個可通過不同翻譯后修飾，表達(dá)為26～35 ku不同分子質(zhì)量的糖基化蛋白。輪狀病毒NSP5結(jié)構(gòu)尚不能完全確定，研究發(fā)現(xiàn)在編碼內(nèi)衣殼蛋白VP6和非結(jié)構(gòu)蛋白NSP2，NSP4和NSP5的保守的基因中，存在一定程度的高遺傳性[6-8]。

Blackhall等[9]研究表明輪狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NSP5由RNA片段11中的基因編碼。NSP5在COS-7細(xì)胞中表達(dá)時，在不受其他病毒蛋白干擾條件下，其均勻分布在細(xì)胞質(zhì)中。在這些條件下，26 ku多肽占優(yōu)勢。在蛋白磷酸酶抑制劑存在下，高度磷酸化形成28 ku和32 ku至35 ku的多肽。此外，完全磷酸化的蛋白質(zhì)在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中具有均勻的細(xì)胞質(zhì)分布。在輪狀病毒SA11感染細(xì)胞中，感染后2 h可檢測到NSP5合成。然而，新形成的26 ku轉(zhuǎn)化為28～35 ku的形式需要大約2 h左右。從轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞中提取的NSP5體外檢測，是有自身磷酸化的功能，表明其不需要其他病毒蛋白參與進(jìn)行磷酸化。用星形孢菌素(廣泛的蛋白激酶抑制劑)處理表達(dá)NSP5的細(xì)胞，對病毒多肽的磷酸化影響有限，說明星孢菌素沒有抑制NSP5體外自磷酸化。

輪狀病毒NSP5蛋白與病毒樣結(jié)構(gòu)(VLS)的形成有關(guān)。在Sen等[10]研究報(bào)告中，NSP5的C末端氨基酸是形成VLS所必需的，是與NSP5的不溶性和高度磷酸化有關(guān)。通過NSP5的C末端計(jì)算機(jī)建模和分析，顯示存在跨越C末端殘基的兩親性α-螺旋。通過研究發(fā)現(xiàn)伴隨著螺旋被破壞，NSP5在VLS中定位也消失。這些研究確定了調(diào)節(jié)VLS形成的NSP5C末端內(nèi)的功能決定簇，并提供了在輪狀病毒復(fù)制過程中抑制NSP5定向VLS功能的靶標(biāo)。

2 輪狀病毒NSP5的相關(guān)功能研究

輪狀病毒(RV)復(fù)制發(fā)生在稱為病毒基質(zhì)的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含物中，輪狀病毒的復(fù)制需要非結(jié)構(gòu)蛋白NSP2和非結(jié)構(gòu)蛋白NSP5的相互作用才能進(jìn)行[11]。NSP5和NSP2之間的相互作用推動了病毒載體的形成，以及輪狀病毒感染細(xì)胞中基因組復(fù)制和包裝的位點(diǎn)。富含絲氨酸-蘇氨酸的NSP5在復(fù)制循環(huán)期間在低磷酸化和高磷酸化異構(gòu)體之間轉(zhuǎn)變。

Jiang等[12]為揭示NSP2如何與NSP5和RNA的相互作用，他們單獨(dú)進(jìn)行NSP2、NSP5和ssRNA復(fù)合物的單粒子冷凍電子顯微鏡(cryo-EM)分析。研究表明，NSP2的結(jié)構(gòu)與晶體八聚體相同，并且NSP5 66-188和ssRNA都與八聚體中帶正電荷的殘基凹槽結(jié)合。

輪狀病毒是在病毒感染細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中形成的。Eichwald等[13]揭示了非結(jié)構(gòu)蛋白NSP2和NSP5與其他病毒蛋白一起定位在病毒中，包括VP1、VP3和VP2。通過酵母雙雜交系統(tǒng)和體內(nèi)結(jié)合/免疫沉淀這兩種不同的測定法，測定研究NSP2與一系列NSP5突變體的相互作用，表明NSP5 N-末端區(qū)域及C-末端部分區(qū)域需要綁定到NSP2才能發(fā)揮作用。

Martin等[14]的研究表明，非結(jié)構(gòu)蛋白NSP5還是可以結(jié)合一個[2Fe-2S]簇的病毒金屬蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，VP1在病毒復(fù)制過程中帶有[2Fe-2S]簇的非結(jié)構(gòu)蛋白NSP5是輔助因子，結(jié)合[2Fe-2S]簇的非結(jié)構(gòu)蛋白NSP5在與單鏈RNA結(jié)合時，其親和力也得到了增強(qiáng)。

Campagna等[15-16]通過靶向基因組區(qū)段11mRNA的siRNA干擾兩種不同的菌株，以特異性方式阻斷了NSP5的翻譯，發(fā)現(xiàn)在病毒的復(fù)制周期中都產(chǎn)生了很強(qiáng)的影響作用，包括：病毒的形成受到了抑制，結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)合成減少，病毒基因組dsRNA的合成減少及傳染性的子代病毒合成減少，說明在病毒的復(fù)制和組裝中NSP5是必需的。還發(fā)現(xiàn)，通過點(diǎn)突變使NSP5的SUMO修飾位點(diǎn)發(fā)生改變后，VLS形成受阻，病毒因此無法完成復(fù)制。Taraporewala等[17]研究表明，輪狀病毒感染細(xì)胞，在體內(nèi)復(fù)制需要一個穩(wěn)定的微管,用于裝配子代病毒結(jié)構(gòu)，并對細(xì)胞核周圍進(jìn)行維護(hù)。用MA104細(xì)胞培養(yǎng)輪狀病毒時，在細(xì)胞周期中的S期分別發(fā)現(xiàn)NSP3、NSP5和VP2 3種輪狀病毒蛋白，研究數(shù)據(jù)表明MA104細(xì)胞在細(xì)胞周期的S期和RV復(fù)制之間有很強(qiáng)的相關(guān)性。Bar-Magen等[18]闡明純化的重組NSP5具有Mg2+依賴性和ATP特異性三磷酸酶活性，其產(chǎn)生游離ADP和Pi；ATPase活性與低水平的NSP5磷酸化相關(guān)，表明ATP水解與NSP5自身激活素活性之間可能存在聯(lián)系。誘變顯示細(xì)胞酪蛋白激酶樣酶對NSP5高磷酸化所需的關(guān)鍵殘基(Ser67)在NSP5的ATPase或自身激活活性中無作用。通過其NDP激酶活性，NSP2八聚體可以通過為NSP5的自激酶活性和與NSP5相關(guān)的細(xì)胞激酶產(chǎn)生恒定的ATP分子來支持NSP5磷酸化。

病毒感染細(xì)胞的免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)得出，除NSP2與NSP5相互作用，VP1、VP2以及VP6與NSP5也存在相互作用。研究發(fā)現(xiàn)，NSP5與其他非結(jié)構(gòu)蛋白無法接觸到核心顆粒的dsRNA，與VP2、VP6的存在有關(guān)；而且發(fā)現(xiàn)輪狀病毒感染細(xì)胞2至3 h后才能在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)檢測到病毒抗原。并在病毒基質(zhì)支架中發(fā)現(xiàn)有4個結(jié)構(gòu)蛋白VP1、 VP2、 VP3和VP6和非結(jié)構(gòu)蛋白NSP2、 NSP5存在[11, 13, 19]。

NSP5的表達(dá)量是輪狀病毒感染過程中判定的關(guān)鍵因素，并根據(jù)NSP5結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行鑒別和分析[20]；在病毒感染細(xì)胞的不同時期，通過NSP5結(jié)構(gòu)的變化，可以作為輪狀病毒在感染、復(fù)制和包裝過程中的一種追蹤蛋白，進(jìn)而探討輪狀病毒感染后，細(xì)胞不同結(jié)構(gòu)區(qū)域的變化進(jìn)而調(diào)控輪狀病毒的感染[21-24]；接下來可以在病毒感染、復(fù)制、包裝和釋放的過程中，探討研究各種蛋白間的相互作用方式，以便調(diào)控RV的感染。通過研究輪狀病毒NSP5的作用，可以從致病機(jī)制中開發(fā)新的治療方法，這將對新疫苗的開發(fā)有重要意義，也將會有助于控制和消除輪狀病毒，從而控制和消除由輪狀病毒引起的對人類健康的危害。