李 佳, 孟 清

(東華大學(xué) 生物科學(xué)與技術(shù)研究所，上海 201620)

蛋白質(zhì)內(nèi)含子(intein)是位于蛋白質(zhì)前體中的一段多肽序列。通過蛋白質(zhì)剪接，它可以從前體蛋白中自我切除，同時將兩端的外顯子以肽鍵的形式連接起來，形成成熟的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)內(nèi)含子根據(jù)其結(jié)構(gòu)特點可分為3種類型：標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)內(nèi)含子、微小蛋白質(zhì)內(nèi)含子和斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子[1-2]。每一類蛋白質(zhì)內(nèi)含子都有3個區(qū)域，N端剪接結(jié)構(gòu)域、中間歸巢核酸內(nèi)切酶區(qū)域或中間連接子(Linker)和C端剪接結(jié)構(gòu)域[3-4]。根據(jù)蛋白質(zhì)內(nèi)含子剪接過程的不同，將內(nèi)含子又分為3種類型，一型、二型和三型蛋白質(zhì)內(nèi)含子[5]。

近年來，蛋白質(zhì)內(nèi)含子在分子生物學(xué)研究中得到了越來越多的應(yīng)用，尤其是斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子的應(yīng)用[2,6]，包括蛋白質(zhì)的純化、蛋白拼接、蛋白的環(huán)化、蛋白標(biāo)記等[7-12]。因此為了不同的研究目的，對蛋白質(zhì)內(nèi)含子的改造和修飾也越來越多。蛋白質(zhì)內(nèi)含子的剪接活性主要和內(nèi)含子保守區(qū)的氨基酸有關(guān)，包括N端第一個氨基酸(Ser或Cys)，C端外顯子第一個氨基酸(Ser、Cys或Thr)以及C端倒數(shù)第一個氨基酸(Asn或Gln)。同時也和幾個保守的模塊相關(guān)，但是很少有和保守區(qū)外其他個別氨基酸相關(guān)。在intein的氨基酸序列中，半胱氨酸屬于比較稀有的氨基酸，而半胱氨酸的巰基又具有穩(wěn)定的化學(xué)特性，是連接和標(biāo)記的重要基團。因此已經(jīng)有文獻報道利用N端、C端無半胱氨酸的斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子進行標(biāo)記[13-14]。但截至目前，可利用的蛋白質(zhì)內(nèi)含子仍非常少。主要是因為大部分intein的N端第一位為半胱氨酸。而N端-1位至-3位的氨基酸也經(jīng)常伴有半胱氨酸[15]。而保守模塊氨基酸的突變大部分會影響intein的剪接活性，甚至導(dǎo)致剪接活性喪失。因此尋找內(nèi)部無半胱氨酸、且剪接活性較好的蛋白質(zhì)內(nèi)含子對于intein的應(yīng)用非常有利。

本文發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)內(nèi)含子HaV01 Pol的N端第1位、N端外顯子的3位和C端外顯子的3位均不是半胱氨酸；而且內(nèi)部的4個半胱氨酸均不在保守模塊內(nèi)[3]。因此我們想通過定點突變等方法將其內(nèi)部半胱氨酸替換成其他氨基酸。最終成功獲得了兩個有剪接活性且內(nèi)部無半胱氨酸的蛋白質(zhì)內(nèi)含子。為該蛋白質(zhì)內(nèi)含子的進一步改造和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 pMHP-CF的構(gòu)建及其剪接活性的檢測

HaV01 Pol全基因序列由日本東京大學(xué)Shmuel Pietrokovski教授饋贈[16]。通過PCR將其序列插入pMall載體內(nèi)，然后利用Western Blot檢測其原始剪接活性，原始質(zhì)粒命名為pMHP[16]。HaV01 Pol含有238個氨基酸(包括N端外顯子3個氨基酸、中間intein序列和C端外顯子3個氨基酸，見圖3)，其中第一位氨基酸為Ser，內(nèi)部含有4個半胱氨酸。設(shè)計4對搭橋PCR引物，將突變堿基設(shè)計到引物內(nèi)部，通過PCR擴增，將突變引入到序列中(引物序列見表1)。最后通過酶切、連接等方法，將突變后的序列插入pMall載體內(nèi)，通過測序得到正確的突變質(zhì)粒，命名為pMHP-CF。接下來將構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coliBL21內(nèi)，誘導(dǎo)表達(dá)，通過Western Blot檢測其剪接活性。

1.2 檢測pMHP內(nèi)部4個半胱氨酸對其剪接活性的影響

通過搭橋PCR的方法(引物見表1)，構(gòu)建4個Cys單獨突變的克隆pMHP-C19/S、pMHP-C112/S、pMHP-C145/S和pMHP-C174/S。將測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coliBL21內(nèi)，誘導(dǎo)表達(dá)，通過Western Blot檢測它們的剪接活性。

1.3 pMHP-C112 only的構(gòu)建及剪接活性的檢測

同樣利用搭橋PCR的方法，構(gòu)建只有112位半胱氨酸存在的突變克隆pMHP-C112-only(引物見表1)。通過Western Blot對其剪接活性進行檢測。

1.4 pMHP-C112 only中半胱氨酸的定點突變及剪接活性的檢測

選擇Gly和Thr進行定點突變(引物見表1)。將構(gòu)建好的質(zhì)粒pMHP-C112/T和pMHP-C112/G轉(zhuǎn)入E.coliBL21內(nèi)，誘導(dǎo)表達(dá)，通過Western Blot檢測其剪接活性。

1.5 DTT濃度的改變和定點突變進一步驗證pMHP的剪接類型

根據(jù)文獻報道[17]，在pMHP-CF上樣緩沖液內(nèi)添加不同濃度的DTT：0、1和2 mmol/L。通過定點突變(引物見表1)將HaV01 Pol一位的Ser突變成丙氨酸Ala。最后通過Western Blot檢測其剪接活性。

表1 PCR引物列

2 結(jié)果與分析

2.1 pMHP-CF的構(gòu)建及內(nèi)含子剪接活性的檢測

通過Western Blot 檢測可以看到HaV01 Pol原始蛋白質(zhì)內(nèi)含子具有較高的剪接活性。在此基礎(chǔ)上，將HaV01 Pol內(nèi)部4個Cys定點突變成Ser，希望仍有較高的剪接活性，可是結(jié)果顯示pMHP-CF沒有任何的剪接活性。這個結(jié)果很令人吃驚，因為4個Cys都位于4個保守模塊之外的非保守區(qū)域。同時我們也沒有改變HaV01 Pol內(nèi)部的氨基酸順序。理論上這種改變即使會影響內(nèi)含子的剪接活性，但不應(yīng)該這么顯著(如圖1)。

綠色：HaV01 Pol的4個保守模塊A、B、F和G；紫色：內(nèi)部半胱氨酸；紅色：剪接必需的氨基酸。RBS1G：表達(dá)剪接的M+T蛋白(55.4 ku)；MT：剪接條帶；MIT：未剪接的前體；MIT*：未發(fā)生剪接的分支狀中間體

圖1 pMHP-CF剪接活性和Cys在HaV01 Pol中的位置

Fig 1 Splicing activity of pMHP-CF and localization of Cys inHaV01 Pol

2.2 檢測pM-HP內(nèi)部4個半胱氨酸對其剪接活性的影響

針對圖1的結(jié)果，我們想要知道4個Cys是怎么調(diào)節(jié)HaV01 Pol的剪接活性的。因此，構(gòu)建了每個Cys/Ser單突變的克隆。通過Western Blot結(jié)果(如圖2)可以看出，pMHP、pMHP-C19/S、pMHP-C145/S和pMHP-C174/S均具有較高的剪接活性，但是pMHP-C112/S和pMHP-CF一樣，幾乎沒有任何的剪接活性(某些X膠片可以看到隱約模糊的條帶，但是經(jīng)過掃描和后期處理，幾乎看不到任何剪接條帶的存在)，都是以前體的形式存在，也沒有任何形式的N端斷裂或C端斷裂[18-19]。這個結(jié)果顯示112位的Cys對剪接的正常進行是非常重要的。但是該位點并不屬于HaV01 Pol的幾個重要模塊(如圖3)，幾個Cys均位于β折疊中間的Linker里面。通過序列比對可以看出，19位和174位Cys突變成Ser后不影響剪接活性是可以理解的，前者Ser和Thr是相似的氨基酸，后者有相似的氨基酸功能團，且都位于β片層中間不保守的位置。145位Cys前面為Pro，理論上更容易導(dǎo)致內(nèi)含子活性的喪失或降低，而本文的突變卻沒有對剪接活性產(chǎn)生任何影響。而112Cys的位置和145Cys類似，只是更接近Linker的中間部分，另外比對結(jié)果并沒有精確的給出112Cys在二級結(jié)構(gòu)中的位置。因此我們猜想112Cys主要作用于蛋白質(zhì)內(nèi)含子完整三維結(jié)構(gòu)的形成[15, 20]。

RBS1G：剪接的M+T蛋白(55.4 ku)；MT：剪接條帶；MIT：未剪接的前體

圖2 4個半胱氨酸分別突變后的剪接活性

Fig 2 Splicing activity of 4 Cys/Ser mutations in pMHP, respectively

“-”：空缺，主要是為了優(yōu)化比對結(jié)果；“*”：相同的氨基酸；“·”：相似的氨基酸；“:”：保守的氨基酸；大方框：N端和C端保留的外顯子；小方框：4個Cys在序列中的位置；下劃線：SspDnaB中的12個β折疊(β1～12)

圖3HaV01 Pol和SspDnaB序列比對

Fig 3 Alignment of amino acid sequence ofHaV01 Pol andSspDnaB

2.3 pMHP-C112 only的構(gòu)建及剪接活性的檢測

既然112位的Cys可以決定內(nèi)含子的剪接活性，那么當(dāng)112位Cys單獨存在時它的剪接情況會怎么樣呢？于是將其余3個Cys突變成Ser，而112位的Cys不變。經(jīng)過Western Blot發(fā)現(xiàn)，pMHP-C112only和pMHP一樣幾乎都有100%的剪接效率(如圖4)。進一步說明只有Cys112，而不是Cys19/145/174對HaV01 Pol的剪接活性產(chǎn)生影響。

2.4 pMHP-C112 only中半胱氨酸的定點氨基酸突變及剪接活性的檢測

既然絲氨酸不能挽救Cys112的功能，那么其他氨基酸是否可以呢？Cys側(cè)鏈為巰基親水性氨基酸，而Thr和Gly側(cè)鏈都具有羥基也為親水性氨基，所以首先選擇這兩種氨基酸進行定點突變。檢測結(jié)果也顯示pMHP-C112/G和pMHP-C112/T均有超過50%的剪接效率，而Thr突變后的效率比Gly突變要高一些(如圖5)。

RBS1G：剪接的M+T蛋白(55.4 ku)；MT：剪接條帶

圖4 pMHP-C112 only的構(gòu)建及剪接活性的檢測

Fig 4 Construction and splicing activity of pMHP-C112 only

RBS1G:剪接的M+T蛋白(55.4 ku)；MT：剪接條帶；MIT：未剪接的前體；MIT*：未發(fā)生剪接的分支狀中間體

圖5 pMHP-C112/G和pMHP-C112/T的剪接活性

Fig 5 Splicing activity of pMHP-C112/G and pMHP-C112/T

2.5 DTT濃度改變和定點突變進一步驗證HaV01 Pol的剪接類型

在后續(xù)的實驗中發(fā)現(xiàn)無論是突變還是原始的內(nèi)含子都會產(chǎn)生一個大于前體蛋白約120 ku的條帶，根據(jù)內(nèi)含子的剪接機制可以推測該條帶是Block G分支中間物[17]。而一般這個產(chǎn)物是只有二型或三型蛋白質(zhì)內(nèi)含子才會產(chǎn)生的剪接條帶。而剪接不充分有可能也會產(chǎn)生類似的條帶。因此通過改變DTT濃度，看這個前體條帶是否會下降，結(jié)果(如圖6-A)顯示前體雖有微弱的下降，但是依然存在。同時，將intein 1位的Ser突變成Ala并檢測其剪接活性，Western Blot結(jié)果顯示突變后的pMHP失去了剪接活性(如圖6-B)，表明HaV01 Pol是一型蛋白質(zhì)內(nèi)含子，而不是三型蛋白質(zhì)內(nèi)含子，因為二型和三型蛋白質(zhì)內(nèi)含子不需要1位的氨基酸。另外，HaV01 Pol也沒有三型內(nèi)含子的典型的WCT結(jié)構(gòu)，氨基酸比對進一步證實了這一點(如圖6-C)。

RBS1G：剪接的M+T蛋白(55.4 ku)；MT：剪接條帶；MIT：未剪接的前體；MIT*：未發(fā)生剪接的分支狀中間體；“+”：正常的DTT濃度1 mmol/L；“++”：增加DTT濃度至2 mmol/L；“-”：沒有添加DTT；cleavage：非正常的斷裂產(chǎn)物；紅色：表示三型內(nèi)含子WCT模塊和一型內(nèi)含子Block B中的T和H兩個保守氨基酸

圖6 Western Blot和比對結(jié)果證明pMHP為一型蛋白質(zhì)內(nèi)含子

Fig 6 pMHP is type I intein by Western Blot and alignment

3 討論

蛋白質(zhì)內(nèi)含子可以發(fā)生自我剪切，將兩端的外顯子序列以肽鍵的形式穩(wěn)定的連接起來。這一性質(zhì)使蛋白質(zhì)內(nèi)含子作為一個非常價值的生物學(xué)工具，被廣泛地應(yīng)用于蛋白質(zhì)純化、蛋白連接、蛋白環(huán)化、蛋白標(biāo)記、抗體的修飾、結(jié)構(gòu)解析等[21-22]。但是因為蛋白質(zhì)內(nèi)含子本身結(jié)構(gòu)的保守性，使其在異源宿主中的表達(dá)和剪接活性受到限制。截至目前，可利用的蛋白質(zhì)內(nèi)含子仍然非常少。因此，對現(xiàn)有蛋白質(zhì)內(nèi)含子進行改造和修飾是擴大其應(yīng)用范圍的必然途徑[23-24]。

將HaV01 Pol內(nèi)部的4個半胱氨酸突變成相似的Ser。令人意外的是，HaV01 Pol內(nèi)部112位的Cys可以決定其剪接活性，而其他3個Cys則不會影響其剪接活性。根據(jù)之前的報道，蛋白質(zhì)剪接時主要形成一個馬蹄形的結(jié)構(gòu)，C端形成一個口袋結(jié)構(gòu)，而N端進入口袋，隨即發(fā)生一系列親和反應(yīng)[25]。我們推測112位Cys的突變可能間接改變了周圍氨基酸的空間位阻，影響了正確空間構(gòu)象的形成，最終導(dǎo)致HaV01 Pol的剪接效率降低[26]。Gly和Thr替換112位的Cys后，發(fā)現(xiàn)剪接效率都很高，尤其后者。Ser和Thr都是極性不帶電荷氨基酸，且功能團相近，可是對HaV01 Pol剪接效率的貢獻卻完全不同。而Gly為極性氨基酸且側(cè)鏈只有一個氫原子，產(chǎn)生的空間位阻較小，可能促進了周圍其他氨基酸的重新排列組合，形成有活性的空間結(jié)構(gòu)[27]。但是這些推測和具體的作用機制都還有待進一步驗證。

本文研究發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)內(nèi)含子HaV01 Pol內(nèi)部非保守區(qū)的112位Cys可以決定其剪接效率，而其他3個則不會。在蛋白質(zhì)內(nèi)含子研究中，第一次發(fā)現(xiàn)這種現(xiàn)象[28]。通過定點突變進一步得到了2個沒有半胱氨酸的，具有高剪接活性的HaV01 Pol突變。后續(xù)主要是通過內(nèi)含子晶體結(jié)構(gòu)的解析，進一步研究112Cys調(diào)節(jié)HaV01 Pol剪接活性的詳細(xì)分子機制[25]。通過序列比對和計算機建模，獲得對應(yīng)的斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子[29]。另外，HaV01 Pol是少數(shù)真核來源的且有較高剪接活性的蛋白質(zhì)內(nèi)含子，在真核生物的應(yīng)用中可能會優(yōu)于其他原核來源的蛋白質(zhì)內(nèi)含子。本文的研究為進一步探索和擴大蛋白質(zhì)內(nèi)含子HaV01 Pol在分子生物學(xué)和化學(xué)生物學(xué)等方面的應(yīng)用提供了可能。