李淑夢(mèng)， 李曼， 孟清

(東華大學(xué) 生物科學(xué)與技術(shù)研究所， 上海 201620)

蛋白質(zhì)內(nèi)含子(intein)是在前體蛋白質(zhì)中的一段多肽序列，其能夠借助自身發(fā)生的催化反應(yīng)由前體蛋白質(zhì)中成功地剪切出來(lái)，同時(shí)將兩側(cè)的蛋白質(zhì)序列(蛋白質(zhì)外顯子，extein)以天然肽鍵連接，形成成熟蛋白質(zhì)[1-2]，這一過(guò)程被稱為蛋白質(zhì)內(nèi)含子介導(dǎo)的蛋白質(zhì)剪接。蛋白質(zhì)內(nèi)含子根據(jù)其結(jié)構(gòu)特征可分為3類，即標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)內(nèi)含子(canonical intein)，微小蛋白質(zhì)內(nèi)含子(mini-intein)和斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子(split-intein)[3]。由標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)內(nèi)含子和微小蛋白質(zhì)內(nèi)含子介導(dǎo)的蛋白質(zhì)剪接稱之為蛋白質(zhì)順式剪接(protein cis-splicing)；由斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子介導(dǎo)的蛋白質(zhì)剪接被稱之為蛋白質(zhì)反式剪接(protein trans-splicing)。蛋白質(zhì)反式剪接的發(fā)現(xiàn)開(kāi)辟了重組蛋白質(zhì)合成的新途徑，即可將一個(gè)蛋白質(zhì)分兩段表達(dá)后再剪接起來(lái)形成完整的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)反式剪接還可用于基因治療[4-7]，轉(zhuǎn)基因植物的防擴(kuò)散[8-9]，高通量的蛋白質(zhì)相互作用的篩選、線粒體蛋白質(zhì)的鑒定[10]，以及蛋白質(zhì)核轉(zhuǎn)運(yùn)成像等[11]；體外蛋白質(zhì)反式剪接可用于核磁共振研究中對(duì)大的蛋白質(zhì)進(jìn)行分段同位素標(biāo)記[12-13]，可用于蛋白質(zhì)芯片的制備[14]；斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子也可被用于蛋白質(zhì)及多肽的環(huán)化[15-16]，使環(huán)化后的蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性和抗蛋白水解酶的能力增加，使環(huán)化后的多肽藥物具有更好的性能。

到目前為止，從原核生物基因組中已經(jīng)分離鑒定了超過(guò)600多個(gè)蛋白質(zhì)內(nèi)含子，且絕大多數(shù)內(nèi)含子都位于DNA復(fù)制、修復(fù)以及轉(zhuǎn)錄相關(guān)的蛋白質(zhì)中。按照現(xiàn)有的剪接機(jī)理假說(shuō)，蛋白質(zhì)剪接反應(yīng)主要依靠1位(蛋白質(zhì)內(nèi)含子N端第一位氨基酸)和正1位(C端蛋白質(zhì)外顯子N端第一位)的氨基酸，認(rèn)為這兩個(gè)位點(diǎn)的氨基酸對(duì)于發(fā)生蛋白質(zhì)剪接至關(guān)重要[17]。但是，當(dāng)把這些蛋白質(zhì)內(nèi)含子克隆并且插入其他生物的蛋白質(zhì)時(shí)，絕大多數(shù)蛋白質(zhì)內(nèi)含子失去了原有的剪接功能[18-19]，即使按照現(xiàn)有的剪接機(jī)理假說(shuō)，將蛋白質(zhì)內(nèi)含子插入靶蛋白質(zhì)中，形成C端蛋白質(zhì)外顯子的第一位氨基酸為C/S/T時(shí),也不發(fā)生剪接反應(yīng)；少部分發(fā)生蛋白質(zhì)剪接，但是剪接效率極低；只有部分蛋白質(zhì)內(nèi)含子插入模式蛋白質(zhì)(如麥芽糖結(jié)合蛋白和硫氧還蛋白)中發(fā)生高效剪接反應(yīng)，少數(shù)蛋白質(zhì)內(nèi)含子能夠在外源蛋白質(zhì)中發(fā)生剪接，剪接效率也很低[20]。

為了提高蛋白質(zhì)內(nèi)含子在生物體內(nèi)和體外的剪接效率，使其真正在蛋白質(zhì)工程研究和應(yīng)用領(lǐng)域中獲得應(yīng)用，我們把能夠在模式蛋白質(zhì)的體內(nèi)和體外剪接合成融合蛋白、但在其他蛋白質(zhì)中不發(fā)生剪接的CnePRP8蛋白質(zhì)內(nèi)含子(真菌病原體CryptococcusneoformansAD血清型剪接體蛋白PRP8中的蛋白質(zhì)內(nèi)含子)定向進(jìn)化。進(jìn)化前和進(jìn)化后1位和正1位的氨基酸并沒(méi)有發(fā)生突變，進(jìn)化前CnePRP8蛋白質(zhì)內(nèi)含子不剪接，進(jìn)化后就發(fā)生高效率的蛋白質(zhì)剪接，表象就是進(jìn)化后的CnePRP8蛋白質(zhì)內(nèi)含子內(nèi)部的氨基酸發(fā)生了7處突變，如圖1。這種剪接現(xiàn)象與科學(xué)家們提出的剪接機(jī)制大不相同。

圖1 進(jìn)化后的Cne PRP8蛋白質(zhì)內(nèi)含子氨基酸突變示意圖Fig 1 Schematic of amino acid mutations in the Cne PRP8 protein intein after evolution

注：中間紅色區(qū)域?yàn)槎ㄏ蜻M(jìn)化之后的CnePRP8蛋白質(zhì)內(nèi)含子，其定向進(jìn)化后突變的氨基酸位點(diǎn)分別被標(biāo)注，其兩端是KanR的N端和C端片段

本研究以我們前期獲得的剪接活性高、通用性好的進(jìn)化后的CnePRP8蛋白質(zhì)內(nèi)含子(命名為CPE)作為研究對(duì)象，通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)內(nèi)含子關(guān)鍵部位的氨基酸進(jìn)行突變、恢復(fù)突變，研究CPE中影響其剪接反應(yīng)的關(guān)鍵氨基酸；通過(guò)對(duì)相鄰剪接位點(diǎn)的蛋白質(zhì)外顯子氨基酸的突變, 研究外顯子影響CPE剪接的關(guān)鍵氨基酸。本研究通過(guò)定向進(jìn)化突變和恢復(fù)突變確定影響CnePRP8蛋白質(zhì)內(nèi)含子剪接反應(yīng)的關(guān)鍵氨基酸，探索其剪接機(jī)理，為獲得具有高剪接效率和通用性的蛋白質(zhì)內(nèi)含子提供一定的理論支持，拓寬蛋白質(zhì)內(nèi)含子的應(yīng)用領(lǐng)域。

1 材料與方法

1.1 突變體克隆的構(gòu)建

引物的設(shè)計(jì)。根據(jù)CPE 7個(gè)突變位點(diǎn)的DNA序列分別設(shè)計(jì)恢復(fù)突變引物(52-P1、52-P2、68-P1、68-P2、114-P1、114-P2、122-P1、122-P2、146-P1、146-P2、152-P1、152-P2、172-P1、172-P2、1位-P1、1位-P2、正1位-P1、正1位-P2)。9對(duì)引物都由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序合成，見(jiàn)表1。

表1 引物序列

本課題前期對(duì)CnePRP8蛋白質(zhì)內(nèi)含子進(jìn)行定向進(jìn)化的結(jié)果圖如圖2所示，克隆體的構(gòu)建過(guò)程為：將CnePRP8蛋白質(zhì)內(nèi)含子插入改造后的PKH載體的KanR合適位點(diǎn)上，并通過(guò)定向進(jìn)化的過(guò)程得到CPE，質(zhì)粒載體PKH的KanR抗性基因的N端具有6His-Tag，同時(shí)在克隆階段CnePRP8蛋白質(zhì)內(nèi)含子內(nèi)部也引入了6His-Tag，最后通過(guò)Western Blot檢測(cè)證實(shí)了其定向進(jìn)化后剪接效率大大提高。通過(guò)對(duì)CPE測(cè)序得到定向進(jìn)化之后蛋白質(zhì)內(nèi)含子內(nèi)部關(guān)鍵位點(diǎn)的氨基酸突變。

以本課題前期獲得的CPE為模板，使用高保真的Phusion酶(NEB公司)，用以上合成的一對(duì)引物或者其組合對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，循環(huán)條件為98℃預(yù)變性30 s；98℃變性5 s，55℃退火15 s，72℃延伸4 min，循環(huán)30次；終止延伸2 min。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收之后用去磷酸化酶DpnI(Thermo公司)切掉磷酸化的模板DNA，反應(yīng)條件為37℃，1 h。酶切后再次回收，送到睿迪生物有限公司測(cè)序，獲得序列正確后即為恢復(fù)點(diǎn)突變后的克隆。

1.2 蛋白質(zhì)的表達(dá)及剪接

將測(cè)序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coliDH5α中，于含有氨芐青霉素(100 μg/mL)的 LB(1 L∶10 g蛋白胨，5 g酵母提取物，10 g NaCl)培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過(guò)夜。

收集菌體后，加入1×SDS-PAGE樣品緩沖液，沸水浴裂解細(xì)胞，收集樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，進(jìn)行Western Blot印跡檢測(cè)(anti-His antibody)，質(zhì)粒載體PKH的KanR抗性基因的N端具有6His-Tag，同時(shí)CPE內(nèi)部也含有6His-Tag，以用于Western Blot檢測(cè)，分析各個(gè)突變體的剪接反應(yīng)，利用Image J軟件分析Western Blot條帶灰度計(jì)算其剪接效率(剪接效率為剪接產(chǎn)物與剪接產(chǎn)物和剩余前體總和的比值)。

2 結(jié)果

為了驗(yàn)證CPE中7個(gè)突變的氨基酸對(duì)蛋白質(zhì)剪接的影響，我們對(duì)CPE中的7個(gè)突變后的位點(diǎn)進(jìn)行了恢復(fù)突變，包含單個(gè)位點(diǎn)的恢復(fù)突變、兩個(gè)位點(diǎn)組合的同時(shí)恢復(fù)突變、部分3個(gè)位點(diǎn)組合的同時(shí)恢復(fù)突變以及蛋白質(zhì)內(nèi)含子1位和正1位的突變，通過(guò)對(duì)其剪接效率來(lái)分析與CnePRP8蛋白質(zhì)內(nèi)含子剪接相關(guān)的氨基酸。

2.1 Cne PRP8蛋白質(zhì)內(nèi)含子經(jīng)過(guò)6輪定向進(jìn)化之后的結(jié)果

本課題前期通過(guò)對(duì)CnePRP8蛋白質(zhì)內(nèi)含子進(jìn)行6輪定向進(jìn)化的過(guò)程，得到了剪接效率高并且通用性較高的CPE。由圖2的Western Blot結(jié)果圖可以看出，前3個(gè)泳道分別是載體PKH、單獨(dú)的CnePRP8蛋白質(zhì)內(nèi)含子PMCP以及定向進(jìn)化之前的CnePRP8蛋白質(zhì)內(nèi)含子(此時(shí)的CnePRP8蛋白質(zhì)內(nèi)含子已經(jīng)插入了PKH載體KanR的138位上)。而后面8個(gè)泳道分別是通過(guò)6輪定向進(jìn)化得到的不同樣品，用ImageJ軟件對(duì)圖片中的條帶灰度進(jìn)行分析，從而估算其剪接效率，得到了最高的剪接效率為78%，并將其命名為CPE。將CPE再次插入PKH載體KanR的不同位置上時(shí)，得到的剪接效率由表2所示，從而證明了CPE具有良好的通用性。在之后的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，選取了剪接效率較高但并未達(dá)到100%的插入169Ser位點(diǎn)的樣品進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 Cne PRP8蛋白質(zhì)內(nèi)含子經(jīng)過(guò)定向進(jìn)化之后獲得的突變體的剪接活性Fig 2 Splicing activity of mutants obtained after directed evolution of Cne PRP8 protein intein

2.2 CPE單個(gè)氨基酸位點(diǎn)恢復(fù)突變結(jié)果

由測(cè)序得知CPE的7個(gè)突變位點(diǎn)為：T52I、S68P、Q114R、G122C、T146I、N152D和S172R。對(duì)CPE的7個(gè)位點(diǎn)分別恢復(fù)突變。以CPE為模板，用表1中相對(duì)應(yīng)的特異性引物和高保真的Phusion酶進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)并切除模板DNA后，轉(zhuǎn)入大腸桿菌中表達(dá)，最后通過(guò)Western Blot印跡檢測(cè)其剪接反應(yīng)，通過(guò)條帶灰度計(jì)算其剪接率。如圖3所示，Precursor(～52.5 ku)， KanR(～31.6 ku)， CPE(～20.9 ku)，其中間一條可能為斷裂產(chǎn)物或His抗性的雜帶。用ImageJ軟件對(duì)圖片中的條帶灰度進(jìn)行分析，從而估算其剪接效率，計(jì)算結(jié)果如表3所示。其中剪接率最低的是CPE-114和CPE-146，分別為58%和59%，說(shuō)明114位和146位的氨基酸對(duì)蛋白質(zhì)內(nèi)含子的剪接反應(yīng)具有較大影響。

1：CPE；2:CPE-52；3:CPE-68；4:CPE-114；5:CPE-122；6：CPE-146；7：CPE-152；8：CPE-172

圖3 CPE的單個(gè)氨基酸位點(diǎn)恢復(fù)突變后的Western Blot
Fig 3 Western Blot result after one amino acid site recovery mutation of CPE

表3 CPE單個(gè)氨基酸位點(diǎn)恢復(fù)突變后的剪接效率

2.3 CPE兩個(gè)組合氨基酸位點(diǎn)同時(shí)恢復(fù)突變結(jié)果

根據(jù)CPE 中7個(gè)突變位點(diǎn)，對(duì)其進(jìn)行兩兩組合。以圖3中單個(gè)氨基酸突變的克隆體為模板，用表1中各對(duì)引物和高保真的Phusion酶進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)并切除模板DNA后，轉(zhuǎn)入大腸桿菌中表達(dá)，最后通過(guò)Western Blot免疫印跡檢測(cè)其剪接反應(yīng)，并估算其剪接率。如圖4所示，Precursor(～52.5 ku)， KanR(～31.6 ku)， CPE(～20.9 ku)，其中一條可能為斷裂產(chǎn)物或His雜帶，用ImageJ軟件對(duì)圖片進(jìn)行分析，從而估算其剪接效率。計(jì)算結(jié)果如表4所示。結(jié)果可以看出，CPE-52-68和CPE-52-114的剪接效率明顯很低，分別為24%和26%，說(shuō)明這兩個(gè)組合的氨基酸同時(shí)突變對(duì)蛋白質(zhì)內(nèi)含子的剪接反應(yīng)影響較大。

A：1為CPE,2為CPE-52-68，3為CPE-52-114，4為CPE-52-122，5為CPE-52-146，6為CPE-52-152，7為CPE-52-172，8為CPE-68-114，9為CPE-68-122，10為CPE-68-146，11為CPE-68-12，12為CPE-68-172。B：1為CPE,2為CPE-114-122，3為CPE-114-146，4為CPE-114-152，5為CPE-114-172，6為CPE-122-146，7為CPE-122-152，8為CPE-122-172，9為CPE-146-152，10為CPE-146-172，11為CPE-152-172

圖4 CPE的兩個(gè)氨基酸位點(diǎn)恢復(fù)突變后的Western Blot
Fig 4 Western Blot result after two amino acid sites recovery mutation of CPE

表4 CPE兩個(gè)組合氨基酸位點(diǎn)恢復(fù)突變后的剪接效率

2.4 CPE部分3個(gè)氨基酸位點(diǎn)恢復(fù)突變結(jié)果

根據(jù)CPE 中7個(gè)突變位點(diǎn)，對(duì)其進(jìn)行部分三三組合。選取了圖3中剪接效率最低的CPE-114和CPE-146，以及圖4中剪接效率最低的CPE-52-68和CPE-52-114為對(duì)象，將其組合成3個(gè)位點(diǎn)的同時(shí)恢復(fù)突變的蛋白質(zhì)內(nèi)含子進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。以圖4中兩個(gè)氨基酸突變的克隆體為模板，用表1中各對(duì)引物和高保真的Phusion酶進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)并切除模板DNA后，轉(zhuǎn)入大腸桿菌中表達(dá)，最后利用Western Blot印跡檢測(cè)，并估算其剪接率。如圖5所示，Precursor(～52.5 ku)， KanR(～31.6 ku)， CPE(～20.9 ku)，其中一條可能為斷裂產(chǎn)物或His抗性的雜帶，用ImageJ軟件對(duì)圖片進(jìn)行分析，從而估算其剪接效率。計(jì)算結(jié)果如表5所示。從結(jié)果可以看出，3個(gè)樣品的剪接效率相差不大，則可以根據(jù)之前的結(jié)果進(jìn)行分析。

1：CPE；2：CPE-52-68-114；3：CPE-52-68-146；4：CPE-52-114-146

圖5 CPE的部分3個(gè)氨基酸位點(diǎn)恢復(fù)突變后的Western Blot
Fig 5 Western Blot result after part three amino acid sites recovery mutation of CPE

表5 CPE部分3個(gè)組合氨基酸位點(diǎn)恢復(fù)突變后的剪接效率

2.5 CPE的1位和正1位突變結(jié)果

1：CPE;2：CPE-one site;3：CPE-positive one site

圖6 CPE的1位和正1位的氨基酸位點(diǎn)突變后的Western Blot
Fig 6 Western Blot result after mutation of the one site and the positive one site amino acids of CPE

對(duì)CPE的1位和正1位分別突變看其對(duì)蛋白質(zhì)剪接的影響。CPE的1位是半胱氨酸Cys，正1位是絲氨酸Ser，將其分別突變成丙氨酸Ala。以CPE為模板，用表1中各對(duì)引物和高保真的Phusion酶進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)并切除模板DNA后，轉(zhuǎn)入大腸桿菌中表達(dá)，最后通過(guò)Western Blot印跡，檢測(cè)其剪接反應(yīng)。如圖6所示，1位和正1位突變的樣品圖中顯示3條帶，Precursor、斷裂產(chǎn)物以及雜帶。圖中沒(méi)有CPE蛋白質(zhì)內(nèi)含子的條帶，則可以看出蛋白質(zhì)內(nèi)含子并沒(méi)有完全剪接，大部分發(fā)生了斷裂反應(yīng)，這是因?yàn)?位和正1位氨基酸殘基的突變，造成蛋白質(zhì)內(nèi)含子無(wú)法進(jìn)行剪接過(guò)程中所必需的親核攻擊反應(yīng)，阻礙了蛋白質(zhì)內(nèi)含子完成整個(gè)剪接反應(yīng)，因此，對(duì)于來(lái)自真核生物的蛋白質(zhì)內(nèi)含子CnePRP8，其1位和正1位氨基酸直接影響其剪接反應(yīng)的進(jìn)行。

3 討論與結(jié)論

現(xiàn)研究表明，蛋白質(zhì)內(nèi)含子的剪接活性與其1位和正1位的氨基酸密切相關(guān)，以進(jìn)行剪接過(guò)程所包括的兩步轉(zhuǎn)酯反應(yīng)和兩步親核攻擊反應(yīng)，但現(xiàn)在關(guān)于蛋白質(zhì)內(nèi)含子剪接機(jī)理的研究大多局限于源自原核生物的蛋白質(zhì)內(nèi)含子，對(duì)于源自真核生物的蛋白質(zhì)內(nèi)含子的剪接機(jī)理少有研究。本課題以源自真核生物的蛋白質(zhì)內(nèi)含子CnePRP8為研究對(duì)象，探索其剪接機(jī)理，希望可以為蛋白質(zhì)內(nèi)含子的剪接機(jī)理提供新的觀點(diǎn)和理論支持。我們通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)內(nèi)含子CnePRP8進(jìn)行定向進(jìn)化，得到具有高剪接效率，且具有一定通用性的新蛋白質(zhì)內(nèi)含子CnePRP8的突變體(CPE)，通過(guò)對(duì)其全長(zhǎng)測(cè)序，確定了該新突變體的氨基酸序列。為探索CnePRP8的剪接機(jī)理，我們對(duì)定向進(jìn)行中突變的氨基酸殘基，進(jìn)行恢復(fù)突變，并突變其關(guān)鍵位置氨基酸，研究參與蛋白質(zhì)內(nèi)含子CnePRP8剪接過(guò)程的相關(guān)氨基酸，以其更廣泛地應(yīng)用于蛋白質(zhì)研究領(lǐng)域。

本文首先通過(guò)對(duì)CPE中的定向進(jìn)化造成的7個(gè)突變的氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行恢復(fù)突變，并通過(guò)Western Blot檢測(cè)其剪接反應(yīng)，評(píng)估其剪接效率。新突變體的剪接效率越低，則說(shuō)明其相對(duì)應(yīng)的突變的氨基酸對(duì)Cne PRP8的剪接反應(yīng)影響越大。Western Blot結(jié)果表明，其中兩個(gè)位點(diǎn)組合同時(shí)恢復(fù)突變的CPE-52-68(I52T，P68S)和CPE-52-114(I52T，R114Q)的剪接效率改變最大，同時(shí)單個(gè)位點(diǎn)突變時(shí)，114(R114Q)和146(I146T)的剪接效率都偏低，說(shuō)明T52I、S68P、Q114R、I146T位點(diǎn)對(duì)CnePRP8的剪接反應(yīng)影響較大；當(dāng)對(duì)其3個(gè)位點(diǎn)的組合突變時(shí)，3個(gè)突變體的剪接效率相差不大，但仍高于CPE-52-68(I52T，P68S)和CPE-52-114(I52T，R114Q)突變體的剪接效率，說(shuō)明3個(gè)突變的組合抑制了CnePRP8蛋白質(zhì)內(nèi)含子的剪接。我們對(duì)兩個(gè)氨基酸恢復(fù)突變體的剪接效率進(jìn)行分析，CPE-52-114(26%)和CPE-68-114(57%)相比可以看出I52T比S68P的影響大；CPE-52-68(24%)和CPE-52-114(26%)相比可以看出S68P比Q114R的影響大；CPE-52-114(26%)和CPE-52-146(50%)相比可以看出Q114R比I146T的影響大。由于對(duì)于真核生物蛋白質(zhì)內(nèi)含子的二級(jí)結(jié)構(gòu)的研究仍然不成熟，所以蛋白質(zhì)內(nèi)含子剪接活性中心所含有的具體氨基酸并不確定。但是我們可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)這幾個(gè)位點(diǎn)氨基酸的突變對(duì)蛋白質(zhì)內(nèi)含子活性中心構(gòu)建的影響。我們對(duì)這4個(gè)位點(diǎn)的氨基酸結(jié)構(gòu)和性質(zhì)進(jìn)行分析：分析52位和146位的氨基酸性質(zhì)得知，從CnePRP8到CPE，52位和146位都是蘇氨酸Thr突變成異亮氨酸Ile，蘇氨酸Thr為極性中性不帶電荷氨基酸，側(cè)鏈基團(tuán)為羥基-CH(CH3)-OH，空間位阻較小，而異亮氨酸Ile為非極性中性不帶電荷氨基酸，側(cè)鏈基團(tuán)為-CH(CH3)-CH2-CH3具有較大的空間位阻，推測(cè)可能會(huì)影響蛋白質(zhì)內(nèi)含子剪接活性中心的重建，由此可以推斷不同極性或側(cè)鏈基團(tuán)的氨基酸的改變對(duì)蛋白質(zhì)內(nèi)含子的剪接具有較大影響；68位點(diǎn)的突變是從CnePRP8到CPE絲氨酸Ser突變成脯氨酸Pro，而絲氨酸Ser為極性中性不帶電荷氨基酸，側(cè)鏈基團(tuán)為-CH2-OH，脯氨酸為非極性中性不帶電荷氨基酸，側(cè)鏈基團(tuán)為-C3H6，Pro通常參與形成蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中的β-turn結(jié)構(gòu)，因此推測(cè)其可能影響蛋白質(zhì)內(nèi)含子的剪接活性中心的空間構(gòu)象；而114位點(diǎn)的突變是從CnePRP8到CPE是谷氨酰胺Gln突變成精氨酸Arg，谷氨酰胺Gln是極性不帶電的氨基酸，而精氨酸Arg是帶正電的堿性氨基酸，氨基酸突變之后帶了正電荷，從而空間結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，影響了CnePRP8蛋白質(zhì)內(nèi)含子的剪接反應(yīng)。而對(duì)于其他幾個(gè)氨基酸位點(diǎn)的影響，其對(duì)于CnePRP8蛋白質(zhì)的剪接是有促進(jìn)作用的，但是對(duì)于CnePRP8蛋白質(zhì)內(nèi)含子的剪接活性中心的構(gòu)建影響較小，當(dāng)然CnePRP8具體的剪接活性中心的高級(jí)結(jié)構(gòu)需要后續(xù)進(jìn)一步的解析和研究?，F(xiàn)有的蛋白質(zhì)剪接機(jī)理表明，決定蛋白質(zhì)內(nèi)含子的剪接反應(yīng)的關(guān)鍵氨基酸是其1位和正1位氨基酸，因此我們對(duì)CnePRP8的1位和正1位氨基酸進(jìn)行突變時(shí)，結(jié)果表明CnePRP8不再發(fā)生剪接反應(yīng)，而僅發(fā)生了蛋白質(zhì)內(nèi)含子的斷裂反應(yīng)，說(shuō)明CnePRP8與其他原核來(lái)源的蛋白質(zhì)內(nèi)含子類似，其1位和正1位氨基酸直接影響其剪接反應(yīng)的進(jìn)行。

綜上所述，本研究通過(guò)定性進(jìn)化與恢復(fù)突變，探索了真核來(lái)源的蛋白質(zhì)內(nèi)含子CnePRP8的剪接機(jī)理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，蛋白質(zhì)內(nèi)含子CnePRP8的1位和正1位氨基酸對(duì)蛋白質(zhì)內(nèi)含子的剪接反應(yīng)具有決定性影響，這與現(xiàn)有的蛋白質(zhì)剪接機(jī)理是相統(tǒng)一的；同時(shí)，通過(guò)恢復(fù)突變研究結(jié)果表明，真核生物來(lái)源的蛋白質(zhì)內(nèi)含子CnePRP8，其剪接反應(yīng)還與其他內(nèi)部位點(diǎn)氨基酸密切相關(guān)，尤其是T52I、S68P、Q114R和I146T 4個(gè)位點(diǎn)的氨基酸的突變。氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)和極性的改變直接影響了CnePRP8蛋白質(zhì)內(nèi)含子的剪接反應(yīng)。本研究為CnePRP8蛋白質(zhì)內(nèi)含子提供了一定的理論支持，為獲得高剪接效率和通用性的蛋白質(zhì)內(nèi)含子奠定基礎(chǔ)，當(dāng)然對(duì)于CnePRP8的剪接活性中心結(jié)構(gòu)的研究和其空間高級(jí)結(jié)構(gòu)的解析等都需要進(jìn)一步的研究和探索。