李瀟，董勝勝，付肖蒙，王鵬飛，董健

（天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457）

酵母多數(shù)普遍存在于富含糖類的環(huán)境中，例如水果（蘋果、葡萄和桃子等）、蔬菜、花蜜和植物分泌物（如仙人掌的汁液）中，以及果園和部分富含石油的土壤中。目前最常見且應(yīng)用最為廣泛的酵母菌種當(dāng)屬釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。

Ras-cAMP信號通路對酵母細(xì)胞的脅迫抗性具有很大的調(diào)節(jié)作用，MSN2基因?qū)儆赗as-cAMP信號通路中的壓力調(diào)控因子，Ras-cAMP信號通路活性的提高就會抑制一些與壓力響應(yīng)元件相關(guān)基因的表達(dá)，其中轉(zhuǎn)錄因子MSN2對壓力響應(yīng)元件相關(guān)的一些基因的表達(dá)是必須的，是Ras-cAMP信號通路抑制壓力響應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)的靶標(biāo)[1]。

MSN2是鋅指蛋白，在對溫度敏感型snf1突變株多拷貝抑制物進(jìn)行分離的過程中得到MSN2基因[2]。Msn2p和Msn4p這兩個反式作用元件在STRE介導(dǎo)的基因表達(dá)方面發(fā)揮作用。轉(zhuǎn)錄因子Msn2p及其同系物Msn4p與STRE結(jié)合，在營養(yǎng)饑餓、熱休克、氧化應(yīng)激、DNA損傷和滲透休克似乎介導(dǎo)基因激活[3]。當(dāng)MSN4過量表達(dá)時可以像MSN2一樣抑制突變snf1的熱敏性[4]。MSN2和MSN4在壓力條件下調(diào)節(jié)大約200個基因的表達(dá)。這兩個蛋白有41%的一致性，在大小和氨基酸序列上很相似，雖然這兩個基因的單缺失菌株沒有明顯的表型特征，但是雙缺失的菌株對碳源饑餓、熱擊、滲透壓及氧化壓力條件都有超級敏感性，而過量表達(dá)這兩個基因能降低對饑餓和熱擊的敏感度[5,6]。

以實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有菌株AY12a為出發(fā)菌株，通過使用胞內(nèi)同源重組方法過表達(dá)MSN2基因，具體內(nèi)容如下：

以實(shí)驗(yàn)室菌株AY12a為出發(fā)菌株，通過胞內(nèi)同源重組法，以URA3基因作為篩選標(biāo)記，將PGK1p啟動子插入MSN2基因的 N端，經(jīng)醋酸鋰化轉(zhuǎn)，抗性板SD篩選正確轉(zhuǎn)化子，通過PCR驗(yàn)證獲得過表達(dá)基因的a型（基因型為AY12a-msn2）。從生長性能，高溫、15%（V/V）乙醇的耐受性、6%NaCl和 5%乙酸等指標(biāo)考察突變株AY12a-msn2的綜合耐受性的改變，同時將突變株與出發(fā)菌株進(jìn)行玉米高溫濃醪發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，并測定發(fā)酵完成后的酒度、殘?zhí)恰?8 h細(xì)胞存活率、CO2失重和發(fā)酵時間。比較突變株及親本菌株的發(fā)酵性能，研究過表達(dá)基因?qū)︶劸平湍笣怩舶l(fā)酵性能的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）AY12a-msn2：本實(shí)驗(yàn)室培育；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）AY12a：本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑

酵母浸粉（生化試劑），北京奧博星生物技術(shù)有限公司；葡萄糖（分析純），天津市永大化學(xué)試劑開發(fā)中心；瓊脂粉（生化試劑），Solarbio公司；胰蛋白胨（生化試劑），天津市英博生化試劑有限公司；氯化鈉（分析純），天津市北方化玻購銷中心；DL5000 DNA Marker（生化試劑），TaKaRa公司；RNA提取試劑盒及熒光定量PCR試劑盒，寶生物工程（大連）有限公司。

1.1.3 儀器

臺式離心機(jī) T gL-16C，上海安亭科技儀器廠；Bioscreen C全自動生長曲線分析儀，芬蘭Oy Growth Curves Ab公司；UVmini-1240島津紫外分光光度計(jì)，島津儀器（蘇州）有限公司。

IS-RDS3恒溫?fù)u床，上海制成儀器制品有限公司；AB204-S型分析天平，梅特勒-托利多儀器上海公司；HS-1300-V型超凈臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；AgilentGC 7890，StepOnePlus?實(shí)時熒光定量PCR儀，Biometra公司。

1.1.4 主要培養(yǎng)基

（1）YEPD培養(yǎng)基

葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母浸粉1%，pH自然，115 ℃滅菌20 min。

固體培養(yǎng)基需再添加2%瓊脂粉。

（2）耐鹽培養(yǎng)基（m/V）：

葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母浸粉1%，NaCl 6%，115 ℃滅菌15 min。

（3）耐酒精培養(yǎng)基（m/V）：

葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母浸粉1%，115 ℃滅菌15 min，待冷卻至室溫，加入15%Vol的無水乙醇。

（4）耐乙酸培養(yǎng)基（m/V）：

葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母膏1%，115 ℃滅菌15 min，待冷卻至室溫，加入5%的乙酸。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的構(gòu)建

1.2.1.1 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)NCBI中GenBank報(bào)道的S. cerevisiae S288C菌株的MSN2和URA3基因序列設(shè)計(jì)PCR反應(yīng)的上下游引物，用以構(gòu)建敲除和驗(yàn)證敲除基因的菌株，同時用以構(gòu)建過表達(dá)和驗(yàn)證過表達(dá)基因的菌株。三引物用來驗(yàn)證菌株的單雙倍體，文中所有用到的引物序列如表1所示。

1.2.1.2 酵母基因組的提取

取新鮮酵母液體培養(yǎng)物，離心收集菌體，提取其基因組DNA，作為PCR的模板，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.1.3 過表達(dá)基因釀酒酵母突變株的構(gòu)建

本文研究以MSN2基因作為靶基因，野生型釀酒酵母工業(yè)菌株AY12a為親本菌株，URA3基因?yàn)楹Y選標(biāo)記，在MSN2基因的N端加入強(qiáng)啟動子PGK1p，以實(shí)現(xiàn)MSN2基因的過表達(dá)。構(gòu)建過程示意圖如圖1所示。

表1 PCR引物設(shè)計(jì)Table 1 PCR primer design

圖1 過表達(dá)MSN2基因的流程圖Fig.1 Overexpression of MSN2 gene flow chart

1.2.1.4 目的片段的擴(kuò)增

以親本菌株AY12a為模板，利用引物對MSN2上同源臂 U和MSN2上同源臂 D、MSN2-URA3U和MSN2-URA3D、MSN2-PGK1PU 和MSN2-PGK1PD、MSN2下同源臂U和MSN2下同源臂D進(jìn)行PCR擴(kuò)增帶有部分同源的四個基因片段。

1.2.2 突變株的獲得

用酵母醋酸鋰轉(zhuǎn)化法[7]將得到的四個目的基因片段化轉(zhuǎn)入原菌AY12a內(nèi)，得到過表達(dá)后的AY12a-msn2菌株。

1.2.3 Real-Time PCR

酵母RNA的提取及RNA的反轉(zhuǎn)錄均按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行操作，使用 SYBR? Premix Ex TaqTMII（TaKaRa）試劑盒進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR，通過ΔΔC(t)值法對目的基因及內(nèi)參基因ACT1進(jìn)行基因表達(dá)量的分析。

1.2.4 突變株AY12a-msn2耐受性的測定

1.2.4.1 釀酒酵母細(xì)胞生長曲線的測定

本實(shí)驗(yàn)采用全自動生長曲線測定儀測定OD600吸光值，操作步驟如下：

（1）挑取斜面菌種1環(huán)接至5 mL YEPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃，180 r/min培養(yǎng)12 h。

（2）吸取上述培養(yǎng)好的菌液40 μL接入裝有360 μL液體YEPD培養(yǎng)基的100孔板的孔中，將100孔板置于設(shè)定的溫度下培養(yǎng)，以YEPD液體培養(yǎng)基為空白對照，每隔0.5 h測定600 nm處的吸光值，以時間為橫坐標(biāo)，OD600值為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線圖。

1.2.4.2 釀酒酵母細(xì)胞耐受性的測定[8]

（1）從斜面挑取一環(huán)酵母菌泥，接入5 mL YEPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃，180 r/min過夜培養(yǎng)。測OD600值，取適量菌液轉(zhuǎn)接入5 mL新鮮YEPD液體培養(yǎng)基中，使其初始OD600值為0.15。

（2）將上述細(xì)胞培養(yǎng)4～6 h至生長對數(shù)期。測量OD600值，用 YEPD液體培養(yǎng)基調(diào)整所有細(xì)胞OD600=1，以保證所有細(xì)胞初始菌體濃度一致。

（3）移液槍分別移取100 μL的菌液于1.5 mL離心管中，實(shí)驗(yàn)組做在55 ℃水浴4 min熱擊處理，對照組不做任何處理。

（4）將實(shí)驗(yàn)組和對照組分別用無菌水稀釋相同的濃度梯度，按照濃度遞減的順序，每個稀釋度取2 μL的菌液整齊的滴于YEPD固體培養(yǎng)基平板上，超凈臺晾干后，封口膜封好倒置于 30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～3 d，觀察菌體的生長，比較不同菌株的耐熱情況。

（5）移取2 μL對照組的菌液整齊的滴于含有6%NaCl的YEPD培養(yǎng)基平板上，超凈臺晾干后，封口膜封好倒置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～3 d，觀察菌體生長，比較不同菌株的耐鹽性情況。

（6）移取 2 μL對照組的菌液整齊的滴于含有15%（V/V）的乙醇的YEPD培養(yǎng)基平板上，超凈臺晾干后，封口膜封好倒置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～3 d，觀察菌體生長，比較不同菌株的耐乙醇情況。

（7）移取2 μL對照組的菌液整齊的滴于含有5%（V/V）的乙酸的 YEPD培養(yǎng)基平板上，超凈臺晾干后，封口膜封好倒置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～3 d，觀察菌體生長，比較不同菌株的耐乙酸性情況。

1.2.4.3 高溫濃醪酒精發(fā)酵酒精濃度的測定

利用酒精比重計(jì)（標(biāo)溫20 ℃）來對酒精產(chǎn)量進(jìn)行測定。

準(zhǔn)確量取100 mL發(fā)酵液加入1 L蒸餾瓶中，加入100 mL蒸餾水后放置于蒸餾裝置上進(jìn)行蒸餾，保持冷卻水開啟，用100 mL容量瓶收集餾出液，定容至100 mL，混勻后將其倒入100 mL量筒中，用酒精計(jì)（標(biāo)溫20 ℃）測酒精度，同時測量溫度，最后換算成20 ℃時的酒精度。

1.2.4.4 還原糖的測定

使用斐林試劑法[9]對發(fā)酵完成后的還原糖進(jìn)行滴定。

（1）斐林試劑的標(biāo)定

吸取斐林試劑甲、乙液各5 mL，置于250 mL三角瓶中，準(zhǔn)確加入20 mL空白液（蒸餾水），并用滴定管預(yù)先加入適量的0.1%標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液，使后面滴定時消耗標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液的量控制在1 mL以內(nèi)，搖勻。待加熱至沸騰后，立即用0.1%標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液滴定至藍(lán)色消失，此滴定操作需在1 min內(nèi)完成，記下滴定葡萄糖溶液的體積Vo。

（2）預(yù)實(shí)驗(yàn)

同上吸取斐林試劑甲、乙液各5 mL，20 mL自來水，置入250 mL三角瓶中，加入體積為V1mL試樣稀釋液和適量的0.1%標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液，搖勻后滴定，以下同標(biāo)定時操作，總耗糖量為V2mL。

（3）正式測定

吸取斐林試劑甲乙液各5 mL，20 mL自來水，置于250 mL三角瓶中，加入V1mL試樣稀釋液及（V2-V1）mL 0.1%標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液，搖勻滴定，以下同標(biāo)定時操作，總耗糖量為VmL。按式1計(jì)算還原糖的濃度。

式中：V-斐林試劑測定值（mL）；V0-斐林試劑標(biāo)定值（mL）；V1-所取試樣稀釋液體積（mL）；C-標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液濃度（g/mL）；n-試樣稀釋倍數(shù)。

1.2.4.5 細(xì)胞存活率的測定

次甲基藍(lán)是一種生物燃料，可鑒別細(xì)胞的死活。當(dāng)酵母細(xì)胞浸于次甲基藍(lán)溶液時，色素滲入細(xì)胞內(nèi)，活細(xì)胞內(nèi)的還原酶能使其脫色，但死細(xì)胞內(nèi)的還原酶由于失活，不發(fā)生脫色作用，故被染成藍(lán)色。

當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行至48 h，將發(fā)酵液搖勻，吸取樣液2 mL，過3層紗布以濾去玉米殘?jiān)?，? mL無菌水洗滌濾布上的殘?jiān)?，將菌液稀釋至合適梯度，取100 μL稀釋后的菌液與900 μL的次甲基藍(lán)染色劑混合均勻，靜置5 min以充分染色，移液槍吸取100 μL加入到血球計(jì)數(shù)板（填滿血球計(jì)數(shù)板）即可，在顯微鏡下觀察數(shù)菌，按式2計(jì)算釀酒酵母發(fā)酵48 h后的細(xì)胞存活率。

式中：X-釀酒酵母發(fā)酵48 h后細(xì)胞存活率，%；C1-血球計(jì)數(shù)板中經(jīng)過次甲基藍(lán)染色劑染色后著色的細(xì)胞數(shù)；C2-血球計(jì)數(shù)板中全部的細(xì)胞數(shù)。

1.2.5 玉米原料高溫濃醪酒精發(fā)酵[10～12]

（1）玉米水解液的制備

稱取1500 g的玉米粉，加入4500 mL 65 ℃～70 ℃的自來水，靜置放置20 min，使玉米顆粒充分吸水膨脹。加入液化酶（α-淀粉酶）0.9 mL，于85 ℃～90 ℃下液化1.5 h，期間前30 min不斷攪拌，使得玉米粉充分溶解。液化完成后轉(zhuǎn)入60 ℃水浴鍋中，并加入3 mL糖化酶，在55 ℃～60 ℃下糖化20 h。糖化完成后，將糖化液用四層濾布過濾，得到澄清濾液，分裝，高壓蒸汽滅菌105 ℃，時間20 min，即為玉米水解液，pH自然。

（2）種子培養(yǎng)基的配制

一級種子培養(yǎng)基：8 Bix°的玉米水解液，添加0.5%的酵母浸粉，每支試管分裝5 mL，105 ℃滅菌20 min，待液體涼透，分別接入一環(huán)菌，30 ℃恒溫靜置培養(yǎng)24 h。

二級種子培養(yǎng)基：12 Bix°的玉米水解液，添加0.5%的酵母浸粉，每個錐形瓶分裝45 mL，105 ℃滅菌20 min，將一級種子液全部倒入100 mL錐形瓶，30 ℃恒溫靜置培養(yǎng)16 h。

（3）同步糖化玉米原料高溫濃醪酒精發(fā)酵

稱取100 g玉米粉于事先洗凈、干燥且稱重的500 mL三角瓶中，加入200 g 60 ℃～70 ℃的自來水和0.2 mL的淀粉酶，調(diào)節(jié)pH至5.5～5.8，攪拌均勻，沸水浴液化，料液溫度達(dá)到90 ℃開始計(jì)時液化90 min，液化過程中不斷攪拌，液化結(jié)果以碘試無藍(lán)色且呈紅棕色為準(zhǔn)。液化完成后冷卻至38 ℃左右，調(diào)節(jié)pH至4.2～4.4，加入0.2 mL的糖化酶，0.36 g尿素，15 mL二級種子液，攪拌均勻，并用35 ℃左右的自來水補(bǔ)足液化過程中損失的水，將發(fā)酵瓶用普通封口膜封好，再加一層PE手套，橡皮筋纏緊，30 ℃，160 r/min條件下培養(yǎng)12 h，后轉(zhuǎn)入38 ℃，160 r/min條件下進(jìn)行搖床發(fā)酵。在此過程中，每隔12 h稱重一次，兩次差值小于1 g即可蒸酒。待發(fā)酵48 h，測48 h細(xì)胞存活率，且此時將發(fā)酵溫度改為30 ℃。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

每組實(shí)驗(yàn)做三個平行，并使用 SPSS 11.5和EXCEL 2013軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)分析（ANOVA）。

2 結(jié)果與討論

2.1 目的片段擴(kuò)增驗(yàn)證

圖2 帶有同源臂的MSN2片段擴(kuò)增驗(yàn)證Fig.2 Verification of MSN2 fragment amplification with homologous arm

以親本菌株AY12a為模板，利用引物對MSN2上同源臂 U和MSN2上同源臂 D、MSN2-URA3U和MSN2-URA3D、MSN2-PGK1PU 和MSN2-PGK1PD、MSN2下同源臂U和MSN2下同源臂D進(jìn)行PCR擴(kuò)增帶有部分同源的四個基因片段，其片段長度大小如下圖2所示。與預(yù)期片段大小一致，可用于下一步實(shí)驗(yàn)。

2.2 突變株獲得的驗(yàn)證

精提陰性對照 AY12a基因組及粗提基因組驗(yàn)證正確的菌株基因組，分別利用驗(yàn)證引物進(jìn)行驗(yàn)證。利用引物對驗(yàn)證MSN2上同源臂-URA3U和驗(yàn)證MSN2上同源臂-URA3D、驗(yàn)證PGK1p-MSN2U和驗(yàn)證PGK1P-MSN2D、驗(yàn)證URA3-PGK1PU-MSN2和驗(yàn)證URA3-PGK1PD-MSN2進(jìn)行過表達(dá)MSN2基因菌株進(jìn)行定點(diǎn)驗(yàn)證，MSN2基因擴(kuò)增出大小為1126 bp、3006 bp、1433 bp的特異性片段，與預(yù)期大小一致，且陰性對照PCR后無此條帶，結(jié)果如圖3所示。

圖3 定點(diǎn)PCR驗(yàn)證MSN2電泳圖譜Fig.3 Verified MSN2 by PCR using specific primers

2.3 RT-PCR結(jié)果

為了進(jìn)一步驗(yàn)證MSN2基因過表達(dá)成功，提取重組菌AY12a-msn2及親本菌株AY12a的總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照方法1.2.3以其為模板進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR對MSN2基因表達(dá)量進(jìn)行分析。從圖4結(jié)果看出AY12a-msn2菌株MSN2基因的表達(dá)量是親本菌株AY12a的4.43倍，結(jié)果差異顯著（p＜0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明過表達(dá)MSN2基因后，導(dǎo)致其轉(zhuǎn)錄水平的增加，RT-qPCR結(jié)果能夠說明MSN2基因過表達(dá)成功。

圖4 AY12a和AY12a-msn2中的MSN2基因相對表達(dá)水平的比較Fig.4 Comparison of relative expression levels of MSN2 gene in AY12a and AY12a-msn2

2.4 釀酒酵母基因突變株與親本菌株生長性能的比較

圖5 菌株的生長曲線Fig.5 Growth curve of strains

利用生長曲線測定儀對親本菌株 AY12a和AY12a-msn2突變菌株在進(jìn)行生長曲線的測定。挑取一環(huán)AY12a和AY12a-msn2菌泥接種于5 mL YPED液體培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)后，按照1.2.4.1方法對親本菌株和突變株在30 ℃和40 ℃下進(jìn)行生長曲線的測定，結(jié)果如圖5所示。

圖5是親本菌株和各個突變株的生長趨勢。根據(jù)各個菌株的生長速度和最終菌體濃度可以看出，在30 ℃的培養(yǎng)條件下AY12a-msn2與親本菌株AY12a的生長速度相比，生長性能基本相一致；當(dāng)生長溫度改為40 ℃時，高溫對突變株AY12a-msn2的生長影響較大，較親本菌株AY12a菌體濃度沒有明顯的提高，且生長對數(shù)期延長。具體的生長情況需要用玉米高溫濃醪發(fā)酵驗(yàn)證。

2.5 釀酒酵母基因突變株與親本菌株耐受性的比較

圖6 菌株的耐受性Fig.6 Stress tolerance of strains

按照材料與方法中1.2.4.2中所描述的方法測定出發(fā)菌株AY12a以及突變菌株AY12a-msn2在55 ℃（4 min）熱擊、15%(V/V)的乙醇、6%的NaCl及5%(V/V)乙酸的脅迫環(huán)境下進(jìn)行耐受性分析。結(jié)果如圖6所示。

根據(jù)圖6可知，在沒有生長壓力的YEPD平板上，出發(fā)菌株AY12a和突變株AY12a-msn2的生長情況基本上是一致的，可見用做耐受性實(shí)驗(yàn)的出發(fā)菌株以及突變菌株的初始菌體濃度基本上保持是一致的。在55 ℃（4 min）熱擊處理造成的環(huán)境壓力下，出發(fā)菌株 AY12a和突變菌株的生長都受到了很大程度的抑制。但相比出發(fā)菌株，在相同的稀釋倍數(shù)下，AY12a-msn2比AY12a的菌落數(shù)較少，說明其熱擊抗性弱于出發(fā)菌株AY12a；在15%(V/V)的乙醇和6%的NaCl造成的環(huán)境壓力下，相同的稀釋倍數(shù)下，AY12a-msn2突變株的菌落數(shù)低于原菌；在 5%(V/V)乙酸造成的環(huán)境壓力下，相比出發(fā)菌株AY12a，突變菌株 AY12a-msn2沒有較大的變化說明 5%(V/V)的乙酸對這些突變株的生長沒有脅迫性。

2.6 釀酒酵母基因突變株與親本菌株的玉米原料高溫濃醪酒精發(fā)酵

表2 突變菌株的發(fā)酵性能和細(xì)胞存活率Table 2 Fermentation performance and survival ratios of mutant strains

按照方法1.2.4，將改造后的菌株AY12a-msn2和出發(fā)菌株AY12a進(jìn)行玉米高溫濃醪發(fā)酵。待發(fā)酵進(jìn)行48 h后，將發(fā)酵液搖勻，取樣液，用三層紗布濾去玉米渣，用無菌水稀釋至合適倍數(shù)，按照方法1.2.4.5進(jìn)行次甲基藍(lán)染色后，放大倍數(shù)×400顯微鏡下檢測48 h細(xì)胞存活率。待發(fā)酵完成后，按照方法1.2.4.3測定發(fā)酵液中乙醇含量，按照方法1.2.4.4測定發(fā)酵液中殘?zhí)堑暮?。結(jié)果如表2所示。

由表 2可知，在 38 ℃濃醪發(fā)酵中，突變株AY12a-msn2的酒度相比出發(fā)菌株AY12a有所下降，殘?zhí)呛棵黠@上升，48 h主發(fā)酵完成后的細(xì)胞存活率有較大提高，且發(fā)酵時間延長。這與細(xì)胞生長曲線的測定結(jié)果是一致的，且與耐受性實(shí)驗(yàn)也大致相符。酵母細(xì)胞發(fā)酵時間的延長，常伴隨著細(xì)胞耐受性的增加，比如高乙醇，高溫，高滲透壓等等，但 AY12a-msn2突變株沒有取得預(yù)期的效果。

2.7 小結(jié)

本實(shí)驗(yàn)以MSN2基因?yàn)榘谢?，釀酒酵母AY12a作為出發(fā)菌株，通過胞內(nèi)重組法，在MSN2基因的N端加上一個強(qiáng)啟動子PGK1p，從而實(shí)現(xiàn)基因的過表達(dá)，今而調(diào)控細(xì)胞耐受性，獲得突變株AY12a-msn2。

釀酒酵母菌株的生長性能分析結(jié)果顯示，突變株AY12a-msn2在40 ℃的生長條件下，生長趨勢明顯慢于AY12a且最終的AY12a-msn2細(xì)胞濃度低于AY12a。釀酒酵母菌株的脅迫環(huán)境耐受性能分析結(jié)果顯示，相比出發(fā)菌株AY12a，耐溫性的結(jié)果顯示為AY12a-msn2較弱。38 ℃下的玉米濃醪發(fā)酵結(jié)果表明突變株AY12a-msn2的乙醇產(chǎn)量下降，與理論不相一致，可能與基因的遺傳背景和個體差異有關(guān)。

3 結(jié)論

3.1 本文以實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有菌種 AY12a為出發(fā)菌株，URA3基因?yàn)楹Y選標(biāo)記，利用胞內(nèi)重組法來實(shí)現(xiàn)MSN2基因的過表達(dá)，成功構(gòu)建過表達(dá)MSN2基因的突變菌株AY12a-msn2。

3.2 對突變株AY12a-msn2進(jìn)行耐受性的測定，發(fā)現(xiàn)突變株AY12a-msn2表現(xiàn)出較差的耐高溫性。同時將突變株與出發(fā)菌株 AY12a進(jìn)行玉米原料高溫濃醪發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，并測定發(fā)酵完成后的各個參數(shù)。突變株AY12a-msn2的乙醇含量較出發(fā)菌株下降，殘?zhí)呛吭黾?，且其發(fā)酵時間延長。