龔頻，張夢璇，李曉凡，王蘭，陳福欣

（1.陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，陜西西安 710021）（2.西安科技大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，陜西西安 710054）

糖尿病是一種嚴重危害人類健康的內(nèi)分泌代謝疾病，其并發(fā)癥已成為繼心腦血管疾病和腫瘤之后人類第三大致死原因。由于糖尿病患者代謝紊亂影響了清除自由基的各種抗氧化酶的活性和表達，引起自由基增多，進而損傷腎臟組織[1]。糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病引起的嚴重和危害性最大的一種慢性并發(fā)癥，一旦進展到糖尿病腎病期，生化指標、腎臟病理情況常呈進行性惡化[2]，但在早期的臨床表現(xiàn)不明顯，其腎損傷尚輕微，這時若給予積極治療，對控制糖尿病腎病的發(fā)生和發(fā)展有重要的意義。而腎對氧化損傷比較敏感，因此抗氧化治療DN的方法越來越受到重視[3]。

原花青素(Proantho cyanidins，PC)屬于多酚類化合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)是基于黃烷-3-醇的C6-C3-C6的黃酮骨架，由兒茶素或者表兒茶素按照不同方式和數(shù)量聚合而成。其廣泛存在于各種植物的核、皮或種籽中，如葡萄籽、藍莓、肉桂、桑椹和野蘋果等植物中均含有較為豐富的原花青素類成分[4]，由于原花青素的分子中具有多電子的羥基部分，使它擁有較強的抗氧化、清除自由基和抑制脂質(zhì)過氧化的能力，是目前發(fā)現(xiàn)的最強效的氧自由基消除劑和脂質(zhì)過氧化抑制劑之一[5]。有研究表明原花青素具有降血糖、降血脂、抗氧化、抗炎、抗癌、治療腸道感染、預(yù)防心血管疾病等藥理活性[6～8]，近年來，越來越多的科研工作者開始關(guān)注原花青素在輔助治療糖尿病方面的作用，但PC對DN是否具有保護作用目前國內(nèi)外尚未見報道。為此，本研究通過建立糖尿病大鼠模型，探討PC對糖尿病大鼠腎的保護作用及可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

24只SD雄性大鼠，SPF級，體重160～200 g，購自西安交大醫(yī)學(xué)院實驗動物中心。動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(陜)2012-003。

1.1.2 藥品與試劑

PC，規(guī)格：每瓶25 g，購于上海源葉生物科技有限公司（批號：S30598）；鏈脲佐菌素(STZ)，規(guī)格：每瓶1 g，美國Sigma公司（批號：SB0130）；血清三酰甘油(TC)、總膽固醇(TG)試劑盒，購于南京建成生物技術(shù)公司；硫代巴比妥酸(TBA)、5,5-二硫代-2-硝基苯甲酸，2,4-二硝基苯肼(DNPH)，均購自上海品純生化科技股份有限公司；考馬斯亮藍 G-250，瑞士阿達瑪斯公司；其他試劑均為分析純。

1.1.3 儀器

全波長掃描式多功能讀數(shù)儀，芬蘭賽默飛世爾科技有限公司產(chǎn)品；血糖儀，德國羅氏公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 模型的制備、分組

選取雄性SD大鼠24只，按照體重隨機分為正常組，模型組，實驗組，每組8只。正常組，給予普通飼料；模型組和實驗組，給予高脂高糖飲食。飼養(yǎng) 6周后，禁食12 h，正常組，大鼠腹腔注射等體積的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH=4.4)；高脂高糖組，大鼠腹腔注射30 mg/kg鏈脲佐菌素。穩(wěn)定1周后，對于空腹血糖＜7.8 mmol/L的大鼠，再次腹腔注射30 mg/kg鏈脲佐菌素。注射 1周后，尾靜脈采血，測血糖≥13.8 mmol/L的大鼠為模型成功。模型組大鼠逐漸出現(xiàn)多飲、多食和多尿等典型的糖尿病癥狀；正常組飲水、攝食量、尿量基本正常，體重明顯增加。造模成功的糖尿病大鼠隨機分為模型組及實驗組，每組8只。

1.2.2 給藥劑量與方法

實驗組，每日腹腔注射150 mg/kg原花青素，其余2組腹腔注射生理鹽水，每天一次，連續(xù)注射4周。

1.2.3 生化指標檢測

空腹12 h后，尾靜脈采血測定。斷頸處死，主動脈取血，離心分離血清，置-80 ℃保存，用于測定血清中 TC、TG、BG的含量；分離腎，取適量腎，于10%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋，供形態(tài)學(xué)觀察；剩余腎組織，于-80 ℃保存，用于檢測腎組織SOD、CAT活性和MDA、PCO的含量。

1.2.4 血清生化指標的測定

按照酶法試劑盒的要求，測定血清 TC、TG和BG含量。

1.2.5 腎臟組織生化指標的測定

取0.5 g腎臟，制成10%的生理鹽水勻漿，離心分離上清液。腎皮質(zhì)勻漿中MDA、PCO、SOD和CAT活性檢測。

總蛋白質(zhì)含量測定

本實驗采用G-250考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)的含量。

大鼠腎臟中超氧化物歧化酶（SOD）活力測定：

SOD是一類含金屬的氧化還原酶，幾乎存在于所有生物細胞中，能夠催化超氧化物通過歧化反應(yīng)轉(zhuǎn)化為O2和H2O2，與動物的壽命呈正相關(guān)，其活性大小可以反映機體清除自由基的能力，是生物體重要的細胞防御系統(tǒng)之一。在堿性條件下，鄰苯三酚迅速氧化釋放出超氧化物陰離子，生成有色中間產(chǎn)物，吸光度隨之增加，使吸光度值與反應(yīng)時間呈良好的線性關(guān)系。SOD加入鄰苯三酚自氧化反應(yīng)體系后，催化超氧化物陰離子生成過氧化氫，使有色中間產(chǎn)物的生成受阻，導(dǎo)致吸光值下降，鄰苯三酚自氧化速率降低，可作為測定 SOD活力的理論依據(jù)。與其他方法相比，鄰苯三酚自氧化法具有操作簡便，快速，試劑便宜且用量小，重復(fù)性好等優(yōu)點。

大鼠腎臟中丙二醛（MDA）含量的測定：

丙二醛(MDA)是組織細胞膜脂質(zhì)過氧化作用后的產(chǎn)物之一。細胞膜脂質(zhì)過氧化的程度可以通過丙二醛濃度大小反映，也可間接通過其濃度大小反映組織的抗氧化能力強弱。酸性條件下，體內(nèi)組織中的MDA在加熱狀態(tài)下與硫代巴比妥酸（TBA）生成粉紅色結(jié)合產(chǎn)物，波長539 nm處結(jié)合產(chǎn)物有最大吸收。遂采用TBA比色法測定臟器組織中MDA的濃度，計算對比得到不同實驗組別脂質(zhì)過氧化的程度。

大鼠腎臟中過氧化氫酶（CAT）含量的測定：

測定組織中CAT含量本實驗采用鉬酸銨比色法。過氧化氫(Catalase，CAT)屬于血紅蛋白酶，含有鐵，它能催化體系中的過氧化氫，分解為H2O和O2，在此過程中起電子傳遞作用，同時殘留的過氧化氫能夠和鉬酸銨反應(yīng)生成黃色復(fù)合物，所以組織中CAT的含量和活性可以用可見分光光度計進行定量。

1.2.6 腎組織形態(tài)學(xué)檢測

用10%中性甲醛固定，石蠟包埋切片，切片厚度5 μm。脫蠟后，用蘇木精和曙紅染色，制片，用光學(xué)顯微鏡進行觀察。

1.2.7 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果與討論

2.1 原花青素對糖尿病大鼠血糖和血脂影響

實驗結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組血糖升高了4.17倍(p＜0.01)，TC、TG明顯升高了4.02倍和6.88倍(p＜0.01)，大鼠出現(xiàn)明顯的“三多一少”的癥狀；與模型組相比，PC能緩解大鼠糖尿病一般癥狀，且對STZ所致糖尿病小鼠有明顯的降血糖作用，實驗組的血糖、TC和TG水平明顯降低了50.84%、55.70%和70.52%（p＜0.05），見表 1。

2.2 原花青素對糖尿病大鼠腎 MDA與 PCO含量的影響

MDA是典型的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物[9]，PCO的含量可以反映蛋白質(zhì)過氧化損傷的嚴重程度。圖1結(jié)果表明，模型組糖尿病大鼠體內(nèi)MDA、PCO含量明顯高于正常組，分別升高了51.10%和81.36%(p＜0.01)，可以看出腎臟功能在一定程度上受到影響，可能是由于機體經(jīng)STZ誘導(dǎo)的過程中，產(chǎn)生活性氧，這些含氧自由基具有未配對的價電子原子，會引起膜脂質(zhì)過氧化的加劇，造成整個細胞膜系統(tǒng)損傷，腎臟損傷是大面積的腎間纖維化即與這一過程直接相關(guān)。在給予原花青素后，腎臟組織MDA、PCO含量顯著降低到21.54%和11.86%（p＜0.01），表明PC可以緩解大鼠體內(nèi)MDA、PCO含量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，表明PC可以減少糖尿病大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激。大量研究認為氧化應(yīng)激在糖尿病腎病發(fā)病過程中起著至關(guān)重要的作用。當DNA發(fā)生后過度氧化應(yīng)激對細胞膜表面進行過氧化，直接損害蛋白核酸[10]。目前，有關(guān)糖尿病腎病發(fā)病機制的研究認為，2型糖尿病患者體內(nèi)胰島素抵抗以及高糖環(huán)境所引起氧化應(yīng)激反應(yīng)、血管新生以及免疫功能紊亂被認為與糖尿病腎病產(chǎn)生密切的相關(guān)[11]。

圖1 PC對糖尿病大鼠腎的影響Fig.1 The effect of PC on diabetic rats kidney

表1 原花青素(PC)對糖尿病大鼠血糖和血脂的影響Table 1 Effects of Proantho cyanidins (PC) on the level of blood glucose and blood fat of diabetic rats in different groups(±s)

表1 原花青素(PC)對糖尿病大鼠血糖和血脂的影響Table 1 Effects of Proantho cyanidins (PC) on the level of blood glucose and blood fat of diabetic rats in different groups(±s)

注：與正常組相比，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001；與模型組相比，#p＜0.05，##p＜0.01，###p ＜0.001。

Group n Blood glucose/(mmol/L) Triglyceride/(mmol/L) Total cholesterol/(mmol/L)Control 8 4.6±0.5 0.56±0.05 2.36±0.21 Model 8 23.8±0.3 4.41±0.48*** 11.85±2.54**Test 8 11.7±0.3 1.30±0.37### 5.25±1.36##

2.3 原花青素對糖尿病大鼠腎CAT與SOD的影響

圖2 PC對糖尿病大鼠腎的影響Fig.2 The effect of PC on diabetic rats kidney

過氧化氫是一種代謝廢物，會損傷機體，CAT可以對這種損傷起到抑制作用。SOD可反映機體抗氧化能力，通過清除體內(nèi)超氧陰離子自由基而保護細胞膜免受損傷[12]。圖2結(jié)果顯示，與正常組比較，糖尿病大鼠腎的CAT和SOD的活性均明顯降低了17.61%和27.88%(p＜0.01)。給與原花青素后，腎臟組織中的SOD、CAT活性明顯升高了26.05%和12.97%（p＜0.01）緩解了大鼠體內(nèi)CAT含量的減少，同時抑制由于糖尿病而引起的SOD含量的降低。表明PC可通過改善機體抗氧化系統(tǒng)的功能，清除機體氧自由基，進而預(yù)防糖尿病腎病的發(fā)生。松樹皮原花青素提取物對糖尿病小鼠有明顯的降低血糖、改善血脂水平的作用，能夠增加高脂聯(lián)用STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠血清中的SOD含量，降低MDA的含量，從而改善機體胰島素抵抗，其與當前的研究結(jié)果相一致[15]。表明PC具有很強的抗氧化活性和清除自由基功能，是一種良好的脂質(zhì)過氧化抑制劑和氧自由基清除劑[13,14]。

2.4 原花青素對糖尿病大鼠腎組織形態(tài)學(xué)的影響

圖3 腎臟病理切片圖Fig.3 Images of the kidney pathologic slice

從圖3的腎組織形態(tài)學(xué)HE染色切片可見，空白組大鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)完整，有正常的腎小球結(jié)構(gòu)，腎小球結(jié)構(gòu)完整并無損害情況。而模型組大鼠則能觀察到明顯的細胞空泡，腎小球明顯皺縮，腎小管結(jié)構(gòu)模糊不清，也能觀察到明顯的細胞空泡，而腎小球系膜和外基質(zhì)也出現(xiàn)了明顯的增生現(xiàn)象。實驗組上述病變有所減輕，腎小球結(jié)構(gòu)基本正常，腎小管的損傷有了明顯的改善。由此表明原青花素能夠減輕糖尿病造成的腎小球和腎小管細胞壓力，降低糖尿病患者體內(nèi)腎臟的損害程度。

原花青素的結(jié)構(gòu)含有多個酚羥基，能競爭性地與氧化物結(jié)合保護脂質(zhì)化合物不被氧化，同時被氧化后釋放出H+，可阻斷自由基鏈式反應(yīng)。韋金英等[16]研究表明葡萄籽原花青素能夠明顯減少db/db小鼠血糖，降低 Scr、BUN和高脂血癥，降低 db/db小鼠的尿8-OHdG水平，抑制腎小管上皮細胞－間質(zhì)轉(zhuǎn)化生成，可能是通過抑制活性氧簇生成，抑制 p38MAPK和ERK 1/2信號通路激活而實現(xiàn)的。王衛(wèi)娜[17]研究發(fā)現(xiàn)葡萄籽原花青素可以通過抑制GLUT2蛋白的表達，減輕DN大鼠的腎臟肥大指數(shù)，在一定程度上改善DN模型大鼠腎臟病理變化，緩解腎臟損傷。我們的研究同樣表明了原花青素通過清除自由基，調(diào)節(jié)體內(nèi)的氧化及抗氧化指標，平衡氧化壓力，從而起到一定的抵抗糖尿病的保護作用。

3 結(jié)論

本實驗通過高脂高糖聯(lián)合小劑量 STZ誘導(dǎo)建立糖尿病大鼠模型，使糖尿病大鼠能量代謝產(chǎn)生紊亂，體內(nèi)自由基增加，機體清除自由基的能力下降，胰島素敏感性下降。結(jié)果顯示，與模型組相比，PC可以顯著降低大鼠血糖和血脂水平（p＜0.01），升高腎臟中的SOD、CAT活性，顯著降低腎組織MDA、PCO含量（p＜0.01），表明PC可通過提高機體抗氧化能力，清除體內(nèi)自由基來預(yù)防和治療糖尿病及其并發(fā)癥，但糖尿病的作用機制非常復(fù)雜，有待進一步研究。