霍小位，王士中，孟祥波，柳亞飛，趙燕燕

（1.河北大學(xué)藥學(xué)院，河北省藥物質(zhì)量分析控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北保定 071002）（2.河北祁一堂藥業(yè)有限公司，河北保定 071002）

甘草（Glycyrrhiza uralensisFisch）是一種豆科植物，具有獨(dú)特的甜味，是常用的食品添加劑。此外，甘草的藥用價(jià)值極高，具有清熱解毒、調(diào)和諸藥之功效，是現(xiàn)代臨床上最為常用的中草藥之一[1]。甘草酸是甘草的主要活性成分，其具有兩種差向異構(gòu)體形式，即 18α-甘草酸（18α-GL）和18β-甘草酸（18β-GL）[2]。兩種甘草酸異構(gòu)體理化性質(zhì)相似，但在藥效和不良反應(yīng)方面卻有很大差異。這兩種異構(gòu)體的水解產(chǎn)物同樣在藥效學(xué)以及藥動(dòng)學(xué)等諸多方面存在著較大差異。因此，需要進(jìn)一步對18α-GL和18β-GL這兩種異構(gòu)體展開深入研究以指導(dǎo)臨床用藥。

研究發(fā)現(xiàn)，藥物在生物體內(nèi)的吸收過程和代謝過程主要由P-糖蛋白（P-gp）和細(xì)胞色素CYP 450酶系調(diào)節(jié)，藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)過程則主要由P-gp介導(dǎo)[3～5]。P-gp是細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運(yùn)功能蛋白，它能夠ATP依賴性地將細(xì)胞中的藥物排出細(xì)胞外。CYP450酶可以將藥物通過C-羥基化等反應(yīng)代謝排出體外，故能夠減小藥物對人體的毒副作用，保護(hù)肝臟等器官。由于對臨床藥物的代謝作用廣泛，CYP3A成為細(xì)胞色素CYP 450家族中最主要的研究對象之一。P-gp和CYP3A酶均廣泛存在于肝臟和腸道中，許多藥物可以經(jīng)過PXR和CAR信號通路影響P-gp和CYP3A酶的表達(dá)，這些藥物便可以作為 P-gp和CYP3A酶的誘導(dǎo)劑或抑制劑[6～8]，從而影響藥物本身的代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)過程。在本研究中我們考察了不同濃度、不同配比的18α-GL和18β-GL對P-gp轉(zhuǎn)運(yùn)功能的影響，以及對CYP3A酶活性的影響，系統(tǒng)探討不同濃度、不同配比的甘草酸差向異構(gòu)體在生物體內(nèi)發(fā)揮藥理作用的最佳組合，這對于藥物相互作用研究和指導(dǎo)臨床合理用藥具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株與動(dòng)物

Caco-2細(xì)胞購于武漢大學(xué)的培養(yǎng)物儲(chǔ)藏中心，Wistar大鼠，體重（200±20）g，購自河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號為SCXK（冀）2013-1-003。

1.1.2 藥物與試劑

Eagle’s minimum essential medium 培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖溶液及胰蛋白酶購于美國HyClone公司；胎牛血清、二甲基亞砜購于Sigma-Aldrich公司；熒光黃購于天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；18α-GL對照品（18α，20β-glycyrrhizic acid）和 18β-GL 對照品（18β，20β-glycyrrhizinic acid）均購于ALPS制藥，批號分別為10B001S和05C11S；睪酮購于德國Dr.Ehrenstorfer公司，批號：10519；6β-羥基睪酮購于美國 Cerilliant公司，批號：FN04141413；羅丹明123、還原型輔酶II、二硫基赤蘚醇、BCA蛋白檢測試劑盒均購自北京索萊寶生物科技有限公司。

1.1.3 器材及儀器

超凈工作臺(tái)為中國安泰公司產(chǎn)品；高壓滅菌鍋為日本三洋公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀為美國Biotek公司產(chǎn)品；倒置相差顯微鏡為日本 Olympus公司產(chǎn)品；MCO-18AIC恒溫培養(yǎng)箱和LC-20ATVP高效液相色譜儀為日本島津公司產(chǎn)品；SPD-20Avp紫外-可見檢測器和 LabSolutions工作站為美國 Bio-Tek公司產(chǎn)品；transwell 6孔細(xì)胞培養(yǎng)板為美國康寧公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 Caco-2細(xì)胞單層模型的建立及緊密性考察

將transwell孔板放在紫外燈下照射24 h。在孔板的底層加入1.5 mL不含血清的MEM培養(yǎng)液，37 ℃培養(yǎng)2 h。在孔板的上層加入不含血清的MEM培養(yǎng)液0.5 mL繼續(xù)培養(yǎng)2 h。細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中生長到一定程度后（80%～90%）消化，接種到 Transwell孔板的上層（AP側(cè)）。細(xì)胞接種密度為 2×105個(gè)/mL?？装逑聦樱˙L側(cè)）加入1.5 mL培養(yǎng)液。在接種后的第1～7 d，每天換液，第8～21 d，隔天換液。自第3 d起，隔日測定一次跨膜電阻值，并計(jì)算細(xì)胞的跨膜電阻（TEER）。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)測3次，取平均值，當(dāng)TEER值大于 500 Ω/cm2時(shí)說明緊密的單層細(xì)胞膜已經(jīng)生成?？缒る娮璧挠?jì)算公式如下：

TEER=(R1-R0)×A

注：其中R1為接種細(xì)胞孔測量的電阻值；R0為空白孔測量的電阻值；A為有效膜面積。

1.2.2 Caco-2細(xì)胞單層模型通透性考察及表觀滲透系數(shù)的計(jì)算

將細(xì)胞接種到上層（AP側(cè)），培養(yǎng)到21 d，棄掉培養(yǎng)液，用PBS將細(xì)胞洗滌2次，吸棄PBS，在AP側(cè)加入3 μmol/L熒光黃0.5 mL，在下層（BL側(cè)）加入1.5 mL的PBS，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，吸取BL側(cè)溶液200 μL，檢測其熒光強(qiáng)度并根據(jù)熒光黃的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算熒光黃的濃度。熒光黃標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：將已制備的熒光黃母液用PBS稀釋成0.1～3.5 μmol/L的梯度濃度，在激發(fā)波長EX=427 nm，發(fā)射波長Em=536 nm條件下，檢測熒光黃的熒光強(qiáng)度。以熒光黃濃度為x軸，以熒光強(qiáng)度為y軸，繪制熒光黃的標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算各孔熒光黃表觀滲透系數(shù)Papp，考察細(xì)胞模型的通透性和完整性。當(dāng)Papp＜0.5×10-6cm/s時(shí)，說明細(xì)胞模型形成了完整的單層細(xì)胞膜。計(jì)算公式如下：

Papp=dQ/(dt×A×C0)

注：其中dQ表示在dt單位時(shí)間內(nèi)藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)量；A表示形成的單層細(xì)胞模型的膜表面積；C0表示在供給池中加入的藥物的初始濃度。

1.2.3 羅丹明123跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)

將培養(yǎng)至第21 d的細(xì)胞用PBS洗滌后進(jìn)行藥物干預(yù)。陰性對照組加入空白完全培養(yǎng)基，陽性對照組加入含P-gp抑制劑VER的培養(yǎng)基，藥物組加入含不同配比藥物的培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。吸棄培養(yǎng)液，在AP側(cè)加入PBS，BL側(cè)加入PBS，平衡30 min。將AP側(cè)和BL側(cè)的PBS小心吸棄。BL側(cè)到AP側(cè)的轉(zhuǎn)運(yùn)：BL側(cè)加1.5 mL羅丹明123工作液，作為供給池，AP側(cè)加0.5 mL PBS作為接收池。將孔板放置在37 ℃恒溫水浴中，60 r/min轉(zhuǎn)速，分別在15、30、60、90、120 min時(shí)從各接收池吸取溶液200 μL，并補(bǔ)足接收池體積。檢測接收池羅丹明123溶液的熒光強(qiáng)度，代入其溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線，求其溶液濃度（μmol/L），由其溶液濃度計(jì)算轉(zhuǎn)運(yùn)量。藥物轉(zhuǎn)運(yùn)量dQ=藥物濃度×接收池溶液體積。羅丹明123轉(zhuǎn)運(yùn)量與轉(zhuǎn)運(yùn)膜面積的比值即為羅丹明123的單位面積累積轉(zhuǎn)運(yùn)量（mol/cm2）。單位面積累積轉(zhuǎn)運(yùn)量=藥物轉(zhuǎn)運(yùn)量dQ/轉(zhuǎn)運(yùn)膜表面積A。根據(jù)Rho-123的轉(zhuǎn)運(yùn)量可求得表觀滲透系數(shù)Papp，進(jìn)而求得它在細(xì)胞中的外排率。外排率的計(jì)算公式如下：

ER=Papp B-A/Papp A-B

注：PappB-A為分泌表觀滲透系數(shù)，PappA-B為吸收表觀滲透系數(shù)。PappB-A與PappA-B的比值為其在細(xì)胞中的外排率（ER）。

1.2.4 肝微粒體制備及蛋白濃度測定

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物禁食24 h，自由給水，脫頸處死后迅速取出肝臟，用冰生理鹽水沖洗，并用濾紙吸干水分。將肝臟剪至小塊，用冰蔗糖溶液沖洗，直至洗出液呈淡黃色或無色，用濾紙將肝臟表層水分吸干，稱重。用剪刀將肝小塊剪碎，加入 4倍體積（V/m）的蔗糖溶液，冰浴勻漿20 s，勻漿液于10240 r/min離心15 min。取上清液，加入88 mmol/L CaCl2（0.1 mL/mL），冰浴振搖5 min，于15110 r/min離心15 min。棄上清液，所得肝微粒體沉淀加其重量2倍的Tris-HCl（pH 7.4）緩沖液混懸均勻，分裝，-70 ℃保存?zhèn)溆?。制得的肝微粒用BCA蛋白試劑盒測定其蛋白濃度。以上操作均在冰上進(jìn)行。

1.2.5 溫孵實(shí)驗(yàn)及樣品處理方法

各組肝微粒體體系均加入精密量取的50 μL睪酮標(biāo)準(zhǔn)品溶液和一定量不同濃度、不同配比的 18α、18β-GL溶液或相同體積溶劑后，緩慢的通N2吹干，加入甲醇-水（1：1，V/V）50 μL復(fù)溶，加入適量肝微粒體使其終濃度為1 mg/mL，以磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.4）補(bǔ)足體積，溫孵體系終體積為500 μL。置于恒溫振蕩器中，37 ℃條件下預(yù)溫孵5 min后在溫孵體系中加入50 μL NADPH，使其終濃度為1 mmol/L，繼續(xù)溫孵30 min。已孵育完樣品置于-20 ℃冰箱中20 min終止反應(yīng)，于15110 r/min離心15 min，取上清液過已活化好的固相萃取小柱，以甲醇作為洗脫劑，將洗脫液在37 ℃水浴中緩慢的通N2吹干，最后用200 μL甲醇-水（1：1，V/V）對殘?jiān)鼜?fù)溶，0.45 μm濾膜過濾，上機(jī)分析。

1.2.6 不同濃度 18α、18β-GL作用下 CYP3A酶活性測定

肝微粒體溫孵體系分為空白對照組和藥物組。藥物組加入不同濃度 18α、18β-GL（濃度分別設(shè)為 1、10、50、100、200、300、400 μg/mL）100 μL，空白對照組加入100 μL藥物溶劑甲醇，各組平行三管。測定不同濃度18α、18β-GL作用下睪酮的代謝產(chǎn)物6β-羥基睪酮的生成量。計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組CYP3A酶的相對活性（%）。公式如下：

酶相對活性(%)=藥物組代謝產(chǎn)物生成量/空白組代謝產(chǎn)物生成量×100%

以空白對照組CYP3A酶活性為100%（用代謝產(chǎn)物 6β-羥基睪酮的生成量表示），當(dāng)藥物組 6β-羥基睪酮生成量多于空白對照組時(shí)，酶相對百分活性數(shù)值大于100%，藥物對CYP3A酶表現(xiàn)為誘導(dǎo)作用；酶相對百分活性數(shù)值小于100%，則為抑制作用。

1.2.7 不同配比 18α、18β-GL作用下 CYP3A酶活性測定

肝微粒體溫孵體系中依次加入甘草酸總濃度分別在 1、10、25、50、75、100 μg/mL 時(shí) 18α、18β-GL采取七個(gè)配比（10：0、8：2、6：4、5：5、4：6、2：8、0：10）的混合液，各組平行三管。測定不同18α、18β-GL總濃度分別在上述七個(gè)配比的作用下睪酮的代謝產(chǎn)物6β-羥基睪酮的生成量。分析同一濃度不同配比，以及同一配比不同濃度的18α、18β-GL對CYP3A酶活性的影響。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果與討論

2.1 Caco-2細(xì)胞單層模型的考察

如圖1所示，隨著培養(yǎng)天數(shù)延長，細(xì)胞模型的跨膜電阻值逐漸增大，當(dāng)培養(yǎng)到21 d時(shí)，各孔跨膜電阻值均大于500 Ω/cm2，表明緊密的單層細(xì)胞已經(jīng)形成。

圖1 細(xì)胞模型跨膜電阻值Fig.1 The TEER of Caco-2 cells

表1 熒光黃表觀滲透系數(shù)Table 1 The Papp of fluorescein in Caco-2 cells

熒光黃結(jié)果如表 1所示，當(dāng) Caco-2細(xì)胞在Transwell孔板上培養(yǎng)至21 d時(shí)，各孔滲透系數(shù)均小于0.5×10-6cm/s，表明完整的單層細(xì)胞膜模型已經(jīng)形成。

2.2 不同配比18α、18β-GL單體對P-gp轉(zhuǎn)運(yùn)功能的影響

羅丹明123是評價(jià)P-gp功能的探針?biāo)幬?，常通過考察羅丹明123在細(xì)胞中的外排率來研究藥物對P-gp功能的影響。根據(jù)課題組前期的研究基礎(chǔ)，本實(shí)驗(yàn)選擇了10 μmol/L作為藥物總濃度。通過建立Caco-2細(xì)胞單層模型，測定轉(zhuǎn)運(yùn)液中羅丹明123的熒光強(qiáng)度，考察在不同配比的藥物干預(yù)下，羅丹明123在細(xì)胞內(nèi)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的情況。如表2所示，不同配比藥物組的羅丹明123由BL側(cè)到AP側(cè)外排量隨18β-GL的比例的增加而增大，當(dāng)18α-GL與18β-GL配比小于5：5時(shí)，羅丹明123在BL到AP側(cè)的累積轉(zhuǎn)運(yùn)量大于空白對照組，表現(xiàn)出對P-gp轉(zhuǎn)運(yùn)功能的誘導(dǎo)作用。當(dāng)藥物配比為0：10時(shí)，羅丹明123在Caco-2細(xì)胞中的外排率最大。當(dāng)藥物配比大于5：5時(shí)，BL側(cè)到AP側(cè)的累積轉(zhuǎn)運(yùn)量均小于空白對照組，表現(xiàn)出對P-gp轉(zhuǎn)運(yùn)功能的抑制作用，隨著18α-GL比例的增加，羅丹明123在細(xì)胞中的外排率減小，18α-GL呈現(xiàn)出對P-gp功能的抑制作用。當(dāng)藥物配比為6：4時(shí)，對P-gp的抑制作用最強(qiáng)，幾乎與陽性藥維拉帕米（VER）的抑制作用相當(dāng)。當(dāng)P-gp外排功能被抑制后，藥物在體內(nèi)停留時(shí)間延長，藥效增強(qiáng)，但同時(shí)應(yīng)考慮藥物毒性的增加。

表2 不同配比藥物對羅丹明123不同時(shí)間由BL側(cè)到AP側(cè)累積轉(zhuǎn)運(yùn)量的影響Table 2 The effect of different concentration of drugs on the transport B-A of Rho123 (±s, n=3)

表2 不同配比藥物對羅丹明123不同時(shí)間由BL側(cè)到AP側(cè)累積轉(zhuǎn)運(yùn)量的影響Table 2 The effect of different concentration of drugs on the transport B-A of Rho123 (±s, n=3)

注：與空白對照組比較，*p＜ 0.05，** p ＜ 0.01。

分組（18α-/18β-GL） 不同時(shí)間各孔累積轉(zhuǎn)運(yùn)量TransportB-A 15 min 30 min 60 min 90 min 120 min空白對照組 1.55 ± 0.026 15.82 ± 0.128 23.57 ± 0.161 55.73 ± 0.029 76.31 ± 0.201 VER 組 1.32 ± 0.025** 12.16 ± 0.149** 14.43 ± 0.197** 19.84 ± 0.102** 21.07 ± 0.111**10：0 1.47 ± 0.013** 14.07 ± 0.162** 15.28 ± 0.149** 37.18 ± 0.027** 47.95 ± 0.054**8：2 1.50 ± 0.017** 14.95 ± 0.165** 16.71 ± 0.128** 45.37 ± 0.065** 68.85 ± 1.141**6：4 1.42 ± 0.011** 13.35 ± 0.103** 14.74 ± 0.153** 28.62 ± 0.111** 36.94 ± 0.813**5：5 1.57 ± 0.026** 16.39 ± 0.125** 38.58 ± 0.149** 63.28 ± 0.058** 95.71 ± 0.208**4：6 1.68 ± 0.018** 16.57 ± 0.116** 44.73 ± 0.135** 75.28 ± 0.149** 100.9 ± 0.307**2：8 1.77 ± 0.021** 18.33 ± 0.131** 47.28 ± 0.006** 86.44 ± 0.166** 119.2 ± 0.149**0：10 1.86 ± 0.015** 19.66 ± 0.115** 51.74 ± 0.117** 99.21 ± 0.217** 130.4 ± 1.026**

2.3 不同濃度18α、18β-GL單體對CYP3A酶活性影響

據(jù)報(bào)道[9]，甘草酸對 CYP3A酶的活性有誘導(dǎo)作用。在本研究中，甘草酸的兩種異構(gòu)體18α、18β-GL單體對CYP3A酶活性的影響不同并且隨其濃度的變化而變化，結(jié)果如圖2所示。其中，18α-GL對CYP3A酶活性具有顯著的抑制作用。研究表明18α-GL能夠劑量依賴性的抑制CYP3A酶的蛋白表達(dá)水平[10]，因此18α-GL對CYP3A酶活性的抑制作用可能與抑制蛋白表達(dá)相關(guān)。臨床聯(lián)合用藥時(shí)，應(yīng)考慮因18α-GL對CYP3A酶活性的抑制作用而導(dǎo)致的藥物的代謝減慢，不良反應(yīng)增加等。當(dāng)18β-GL濃度在10～50 μg/mL范圍內(nèi)，6β-羥基睪酮生成量增多，表明對CYP3A酶活性有明顯誘導(dǎo)作用；當(dāng)濃度為1 μg/mL，或濃度大于100 μg/mL時(shí)，對CYP3A酶活性影響較小。王宇光[11]報(bào)道18β-GL在20～80 μg/mL的濃度范圍內(nèi)能夠上調(diào)CYP3A酶的mRNA水平。因此，18β-GL濃度在10～50 μg/mL時(shí)對 CYP3A酶活性的誘導(dǎo)作用可能與上調(diào)CYP3A酶的mRNA水平相關(guān)。在臨床聯(lián)合用藥時(shí)，應(yīng)考慮因18β-GL對代謝酶的誘導(dǎo)作用所導(dǎo)致的合用藥物的代謝加快，藥效降低，以及耐藥性的產(chǎn)生。

圖2 不同濃度的18α、18β-GL單體對CYP3A酶活性影響Fig.2 Effect of different concentrations of 18α, 18β-GL on the activity of CYP3A

2.4 不同配比、不同濃度18α、18β-GL混合液對CYP3A酶活性影響

圖3 相同濃度、不同配比的18α與18β-GL對CYP3A酶活性的影響Fig.3 Effect of different ratios of 18α, 18β-GL at the same concentration on the activity of CYP3A

實(shí)驗(yàn)考察了18α與18β-GL在同一濃度不同配比（10：0、8：2、6：4、5：5、4：6、2：8、0：10）以及同一配比不同濃度（1、10、50、100、200、300、400 μg/mL）對CYP3A酶活性的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3、圖4所示，在總濃度固定時(shí)，不同配比18α、18β-GL對 CYP3A酶活性的影響不同。在甘草酸濃度為10 μg/mL，18α與18β-GL配比為2：8時(shí)，對CYP3A酶誘導(dǎo)作用最強(qiáng)。隨著甘草酸總濃度增大、18α-GL比例增加，對CYP3A酶活性的抑制作用逐漸增強(qiáng)。當(dāng)濃度為100 μg/mL、18α與18β-GL配比為10：0時(shí)，對CYP3A酶抑制作用最強(qiáng)。該研究結(jié)果可以對臨床聯(lián)合用藥的安全性和有效性提供指導(dǎo)，但也存在一些不足和局限性，仍需在mRNA及蛋白表達(dá)水平來探究藥物對酶活性影響。

圖4 同一配比、不同濃度的18α與18β-GL對CYP3A酶活性的影響Fig.4 Effect of different concentrations of 18α, 18β-GL at the same ratio on the activity of CYP3A

3 結(jié)論

本研究考察了不同濃度配比的18α-GL和18β-GL對P-gp轉(zhuǎn)運(yùn)功能和對CYP3A酶活性的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)18α-GL和18β-GL配比為6：4時(shí)，對羅丹明123的外排作用最弱，表明對P-gp的抑制作用最強(qiáng)；當(dāng)18α-GL和18β-GL配比為0：10時(shí)，對羅丹明123的外排作用最強(qiáng)，表明對P-gp的誘導(dǎo)作用最強(qiáng)。此外，對 CYP3A酶活性的研究結(jié)果顯示，18α-GL濃度在50～100 μg/mL范圍內(nèi)，對CYP3A酶活性有明顯抑制作用。18β-GL濃度在10～50 μg/mL 范圍內(nèi)，對CYP3A酶活性有明顯誘導(dǎo)作用。在甘草酸總濃度為10 μg/mL時(shí)，18α、18β-GL比例為2：8時(shí)，對CYP3A酶活性誘導(dǎo)作用最強(qiáng)，高于相同濃度的18β-GL單體。隨著藥物濃度及18α-GL比例增加，對CYP3A酶活性的抑制作用增強(qiáng)。當(dāng)濃度為100 μg/mL、18α與18β-GL配比為10：0時(shí)，對CYP3A酶抑制作用最強(qiáng)。綜上所述，不同配比的18α、18β-GL對P-gp轉(zhuǎn)運(yùn)功能及對CYP3A酶活性的影響不同。本實(shí)驗(yàn)將為研究18α、18β-GL的相互作用、指導(dǎo)臨床用藥安全及新藥研發(fā)開拓新思路。