張永紅， 朱 峰， 唐芬芬， 邵榆嵐， 白興榮

(云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所，云南蒙自 661101

家蠶能量代謝過程中，精氨酸在精氨酸酶的作用下水解成鳥氨酸和尿素[1-2]，其中δ-鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ornithine-δ-aminotransferase，δ-OAT)作為鳥氨酸代謝途徑中的關(guān)鍵酶，對脯氨酸合成起著重要作用[3]，而脯氨酸參與機(jī)體的能量代謝[4]；家蠶感染BmNPV以后新陳代謝明顯加快，家蠶體內(nèi)能量代謝水平會高于或低于未感染家蠶[5]，因此研究Bmoat基因?qū)α私馄鋮⑴c家蠶感染BmNPV后免疫應(yīng)答功能和能量供應(yīng)的一些補(bǔ)償機(jī)制具有重要意義。

δ-鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶是1種線粒體基質(zhì)酶，它主要在生物機(jī)體合成脯氨酸過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[6-7]，其cDNAs從酵母到人的多種物種中得到分離，δ-OAT幾乎在動物各種組織中表達(dá)，當(dāng)外界生理刺激侵入機(jī)體時該酶能在特異組織產(chǎn)生應(yīng)答[8]。果蠅δ-鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因與哺乳動物相比具有較高的同源性，其編碼47 ku大小的蛋白，該基因在果蠅的脂肪體內(nèi)高效表達(dá)[9]。在植物擬南芥體內(nèi)，δ-OAT蛋白氨基酸序列同樣與酵母、哺乳動物等序列高度同源，在土壤鹽分高濃度脅迫條件下，δ-OAT蛋白活性和oat基因mRNA水平顯著高于正常條件下培養(yǎng)的植株[10]，再者轉(zhuǎn)基因煙草體內(nèi)過量表達(dá)δ-OAT蛋白能夠增加植株的抗逆性[11]。You等研究發(fā)現(xiàn)通過轉(zhuǎn)基因使小鼠過量表達(dá)δ-OAT蛋白，小鼠在干旱和高滲透壓環(huán)境下抗逆性增強(qiáng)[12]。與哺乳動物相比，關(guān)于昆蟲δ-OAT基因相關(guān)研究較少；δ-鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶參與了家蠶能量代謝，至今鮮有相關(guān)Bmoat基因在免疫應(yīng)答機(jī)理方面的報道。本研究克隆δ-鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶編碼基因，對該基因進(jìn)行生物信息學(xué)及轉(zhuǎn)錄情況分析，并結(jié)合BmNPV侵染明確其表達(dá)規(guī)律對防御BmNPV的免疫應(yīng)答機(jī)制，為探索基因在家蠶免疫方面的功能和防御應(yīng)答模式提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及主要試劑

家蠶品種P50和BmNPV，均由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所保存。本試驗(yàn)使用病毒濃度為5.27×106/mL。

MiniBEST Universal RNA Extraction Kit、M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR相關(guān)試劑、熒光定量SYBR Primix ExTaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)試劑盒，均為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；引物、凝膠回收試劑盒及其他化學(xué)試劑，均為生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 家蠶樣品的采集 家蠶正常條件飼養(yǎng)至5齡3 d，收集家蠶幼蟲頭部、血液、中腸、脂肪體、馬氏管、絲腺、精巢和卵巢組織樣品；在家蠶飼養(yǎng)過程中，收集家蠶蟻蠶至上蔟不同發(fā)育時期個體；在BmNPV處理的試驗(yàn)中，家蠶按常規(guī)方法飼養(yǎng)至5齡起蠶后分為2組，其中試驗(yàn)組每頭蠶添食10 μL BmNPV多角體懸浮液(5.27×106/mL)，對照組添食等量的ddH2O。添食后在相同條件下飼養(yǎng)。采集添食BmNPV或ddH2O后3、6、12、24 h家蠶的中腸組織，采集的樣品進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，每個重復(fù)至少取5頭蠶，采集的樣品置于 -80 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 家蠶總RNA提取及cDNA合成 家蠶中腸組織用液氮充分研磨，根據(jù)MiniBEST Universal RNA Extraction Kit總RNA提取試劑盒抽提RNA。在紫外分光光度計(jì)上測定組織RNA樣品濃度和純度，保留D260 nm/D280 nm比值在1.8～2.0之間的樣品，按照M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶使用說明書將抽提的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.2.3 BmOAT序列分析 參照家蠶基因組數(shù)據(jù)庫(http：//silkworm.genomics.org.cn/)設(shè)計(jì)Bmoat的引物(表1)。將提取的家蠶5齡3 d各組織總RNA反轉(zhuǎn)成cDNA。以家蠶脂肪體組織cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35個循環(huán)；最后72 ℃終延伸10 min。膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，純化后的PCR產(chǎn)物連接至pMD18-T載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10，利用M13引物擴(kuò)增驗(yàn)證陽性克隆，陽性菌液送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。對BmOAT蛋白的分子量、等電點(diǎn)(http：//web.expasy.org/compute_pi/)、信號肽(http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)、功能結(jié)構(gòu)域(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)、蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)(http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)和三級結(jié)構(gòu)(https：//swissmodel.expasy.org/)進(jìn)行在線預(yù)測；用GeneDoc軟件對BmOAT與其他物種δ-鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶進(jìn)行多序列比對，用MEGA 5.0軟件[13]中的鄰接法(neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(Bootstrap 1 000次重復(fù)檢驗(yàn)進(jìn)化樹的可靠性)。

表1 本研究所用引物

1.2.4Bmoat基因時空轉(zhuǎn)錄情況分析 根據(jù)Bmoat基因序列設(shè)計(jì)RT-PCR半定量與qRT-PCR熒光定量引物，由表1可知，Bmactin3為內(nèi)參基因，以家蠶5齡3 d幼蟲各組織器官及蟻蠶5齡7 d幼蟲組織器官cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，RT-PCR擴(kuò)增條件：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30，72 ℃ 30 s，共31個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠檢測。qRT-PCR反應(yīng)儀器為StepOnePlus Real-Time system(Life technologies)，參照SYBR Primix ExTaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)試劑盒操作說明配制熒光定量反應(yīng)體系，反應(yīng)體系為 20 μL(SYBR預(yù)混液10 μL，ROX Reference Dye 0.4 μL，10 μmol/L 上下游引物各0.4 μL，模板1 μL，ddH2O 7.8 μL)，反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 30s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)。每個樣品進(jìn)行3次重復(fù)，收集試驗(yàn)組和對照組目的基因與內(nèi)參基因的Ct值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。采用2-ΔΔCt計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量，其中ΔΔCt=(Ct靶標(biāo)-Ct內(nèi)參)處理-(Ct靶標(biāo)-Ct內(nèi)參)對照。同樣以BmActin3為內(nèi)參基因，家蠶蟻蠶5齡7 d幼蟲各組織器官的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對家蠶整個幼蟲時期目的基因轉(zhuǎn)錄情況進(jìn)行分析。

1.2.5 BmNPV感染家蠶5齡幼蟲后Bmoat的轉(zhuǎn)錄分析 設(shè)計(jì)Bmoat的熒光定量PCR引物，由表1可知，在BmNPV處理的試驗(yàn)中，以不同時間段的2組家蠶中腸組織cDNA為模板，Bmactin3為內(nèi)參基因進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR檢測，反應(yīng)條件及目的基因相對表達(dá)量的計(jì)算方法同“1.2.4”節(jié)。

2 結(jié)果與分析

2.1 Bmoat克隆與序列分析

根據(jù)家蠶基因組數(shù)據(jù)庫設(shè)計(jì)Bmoat特異性引物，以家蠶5齡3 d中腸組織cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，目的基因片段經(jīng)過克隆并測序。結(jié)果顯示，BmoatORF全長為1 224 bp，編碼407個氨基酸，信號肽預(yù)測為非分泌型蛋白；通過NCBI Conserved Domain Search在線工具發(fā)現(xiàn)，8～402位氨基酸為磷酸吡啶依賴酶(pyridoxal phosphate，PLP)的轉(zhuǎn)氨酶結(jié)構(gòu)域(Trysin-like serine protease domain)。預(yù)測分子量為 44.7 ku，理論等電點(diǎn)為6.36。利用PSIPRED Server在線軟件預(yù)測BmOAT蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)(圖1-A)，預(yù)測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BmOAT蛋白由12個α螺旋、14個β折疊和一些無規(guī)則卷曲構(gòu)成；通過SWISS-MODEL同源建模預(yù)測BmOAT蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)，構(gòu)建三維結(jié)構(gòu)圖(圖1-B)，與其二級結(jié)構(gòu)特征一致。

BmOAT的氨基酸序列(BGIBMGA003564-TA)與NCBI上登錄的其他昆蟲δ-鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶進(jìn)行多序列比對。結(jié)果顯示，序列中均含有磷酸吡啶依賴酶的轉(zhuǎn)氨酶結(jié)構(gòu)域(圖2)；其中BmOAT與棉鈴蟲OAT(GenBank登錄號：XM_021337832)序列同源性最高，為84.3%。利用MEGA 5.0軟件，采用鄰接法對上述鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3)，進(jìn)化分析結(jié)果顯示，不同物種鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶聚為2支(CladeⅠ和Clade Ⅱ)，BmOAT與棉鈴蟲和小菜蛾氨基轉(zhuǎn)移酶在親緣關(guān)系上較近。

2.2 Bmoat時空轉(zhuǎn)錄情況分析

通過半定量RT-PCR對Bmoat在5齡3 d各組織的表達(dá)進(jìn)行檢測。組織轉(zhuǎn)錄情況分析發(fā)現(xiàn)，Bmoat在家蠶各個組織均有轉(zhuǎn)錄(圖4-A1)，以精巢相對表達(dá)量最高(圖4-A2)。對家蠶蟻蠶整個幼蟲時期進(jìn)行表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)，Bmoat基因在家蠶整個幼蟲時期持續(xù)性表達(dá)(圖4-B)。

2.3 BmNPV感染家蠶后Bmoat的轉(zhuǎn)錄分析

為了檢測Bmoat是否參與家蠶的免疫應(yīng)答，以添食ddH2O的5齡起蠶作為試驗(yàn)組，BmNPV處理的起蠶為試驗(yàn)組，利用實(shí)時熒光定量qRT-PCR(圖4)對Bmoat在中腸的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，與對照組相比，試驗(yàn)組家蠶感染BmNPV 3 h后BmoatmRNA轉(zhuǎn)錄水平開始升高，而感染 6 h 時無明顯變化，至感染12、24 h時開始下調(diào)表達(dá)，這說明Bmoat的表達(dá)受病原微生物BmNPV入侵的影響，BmNPV侵染家蠶的第一道屏障是中腸，再結(jié)合其在正常家蠶中Bmoat基因表達(dá)水平，認(rèn)為它在防御BmNPV方面發(fā)揮著重要的作用。

3 結(jié)論與討論

δ-鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶是一種線粒體基質(zhì)酶，它主要參與生物機(jī)體能量代謝。本研究成功克隆獲得Bmoat基因(BGIBMGA003564-TA)，其基因序列由9個外顯子和8內(nèi)含子組成，編碼區(qū)全長1 224 bp，編碼407個氨基酸，屬非分泌性蛋白，預(yù)測分子量為44.7 ku，等電點(diǎn)為6.36。氨基酸多重序列比對分析結(jié)果表明，BmOAT與棉鈴蟲OAT序列同源性最高(84.3%)；而系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹顯示，家蠶與鱗翅目昆蟲棉鈴蟲和小菜蛾轉(zhuǎn)氨酶同聚在CladeⅠ一個分支上。微生物、昆蟲、植物和動物δ-OAT中均含有磷酸吡啶依賴酶PLP的保守結(jié)構(gòu)域[14]，BmOAT與鱗翅目昆蟲棉鈴蟲和小菜蛾OAT序列具有高度保守的底物特異性位點(diǎn)，因此可利用底物類似物、基因定點(diǎn)突變等方式來預(yù)防農(nóng)林害蟲。

在對BmOAT蛋白進(jìn)行酶活測定時發(fā)現(xiàn)[15]，該蛋白在家蠶5齡期間、羽化后乃至蛹期仍具有較高活力，加之Bmoat基因在家蠶各個組織中均有表達(dá)且整個幼蟲時期呈持續(xù)性表達(dá)，說明該基因在家蠶整個生理周期都表達(dá)；脂肪體作為昆蟲氨基酸代謝的重要場所，oat基因在雙翅目昆蟲果蠅脂肪體高豐度表達(dá)[9]，而Bmoat基因在家蠶的性腺組織高量表達(dá)(圖4-A2)，這可能與基因轉(zhuǎn)錄的剪切方式和氨基酸代謝有關(guān)，有待近一步驗(yàn)證。

中腸是家蠶防御BmNPV等病源微生物的重要免疫場所，本研究以家蠶中腸作為探索Bmoat基因是否參與免疫響應(yīng)的對象，家蠶添食BmNPV病毒粒子后，感染組和對照組目的基因熒光定量結(jié)果表明，Bmoat基因轉(zhuǎn)錄水平在家蠶感染BmNPV后發(fā)生明顯變化，在感染3 h時呈上調(diào)趨勢，在家蠶感染BmNPV病毒粒子早期，宿主體內(nèi)病毒數(shù)量較少，BmNPV作為免疫刺激因子誘導(dǎo)了Bmoat基因的表達(dá)，家蠶為防御病毒入侵而新陳代謝加快，產(chǎn)生更多能量；而在感染6 h時基因表達(dá)量無明顯變化，感染至12、24 h時均表現(xiàn)出明顯下調(diào)，此時隨著BmNPV感染時間的延長，病毒在宿主體內(nèi)大量繁殖，吸收和消耗了大量蠶的養(yǎng)分，使蠶缺乏營養(yǎng)，抑制了目的基因的表達(dá)，進(jìn)而產(chǎn)生上述的試驗(yàn)結(jié)果。