胡秀榮 黃振東 蒲占湑 杜丹超 陳國(guó)慶 鹿連明

（浙江省柑橘研究所 臺(tái)州318026）

柑橘黑點(diǎn)病在浙江柑橘產(chǎn)區(qū)經(jīng)常發(fā)生，嚴(yán)重影響果實(shí)外觀品質(zhì)，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，是當(dāng)前柑橘重點(diǎn)防治的對(duì)象。目前生產(chǎn)上防治黑點(diǎn)病主要以代森錳鋅為主，一年噴藥4～5次，由于該藥劑多年連續(xù)使用，再加上農(nóng)戶噴藥過程中經(jīng)常隨意加大用藥濃度，勢(shì)必造成農(nóng)藥的殘留和環(huán)境的污染，因而開發(fā)低殘留、對(duì)環(huán)境友好的生物農(nóng)藥很有必要，本研究試圖從浙江大陳島海域采樣分離微生物，從中篩選出具有拮抗活性的菌株，為開發(fā)新的生物農(nóng)藥提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 海洋微生物的分離

1.1.1 樣品的采集。為排除陸地微生物的干擾，從遠(yuǎn)離大陸的大陳島（下大陳島）周邊海域取樣，樣品包括新出海的魚類、貝類、蝦類以及潮間帶的泥沙，將采集的樣品放入裝有冰塊的保溫箱，24h 內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行微生物的分離[1]。

1.1.2 分離培養(yǎng)基。共選用5種分離培養(yǎng)基，成分如下：G1：可溶性淀粉20g，KNO31.0g，K2HPO40.5g，MgSO40.5g，NaCl0.5g，F(xiàn)eSO40.01g，瓊脂20g，人工海水1000ml；M1：葡 萄 糖10g；天 冬 氨 酸0.5g；K2HPO40.5g；MgSO4·7H2O0.05g；瓊脂20g；人工海水1000ml；M2：瓊脂20g；人工海水1000ml；PDA：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，人工海水1000ml；NA：牛肉浸膏3g，蛋白胨5g，葡萄糖2.5g，瓊脂20g，人工海水1000ml。

其中人工海水是采用Sigma 公司生產(chǎn)的海鹽40g加入1000ml 的純凈水溶解而成。G1、M1和M2三種培養(yǎng)基中均加入萘啶酮酸15μg/ml、制霉菌素50μg/ml和放線菌酮50μg/ml[3]。

1.1.3 海洋微生物的分離與培養(yǎng)。將采集魚類、貝類和蝦類的樣品用無(wú)菌剪刀剪碎，取1g樣品，放入4ml的無(wú)菌水中，55℃熱激10min，劇烈搖動(dòng)，再將樣品1:4稀釋，取20μL 稀釋液均勻涂布于5種分離培養(yǎng)基平板上，28℃培養(yǎng)2～6周，待菌落長(zhǎng)出，挑取菌落進(jìn)行轉(zhuǎn)接純化，純化培養(yǎng)的菌株再接種到含分離培養(yǎng)基的試管中培養(yǎng)，然后放于4℃冰箱保存?zhèn)溆肹2]。

1.2 拮抗菌株的篩選

1.2.1 指示菌平板的制備。柑橘黑點(diǎn)病菌由本實(shí)驗(yàn)室從發(fā)病的柑橘果實(shí)上分離并保存。將保存的柑橘黑點(diǎn)病菌轉(zhuǎn)接于PDA培養(yǎng)基平板上，置于28℃的微生物培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待菌落長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)皿，用直徑6mm的打孔器打取菌餅，置入PDA 培養(yǎng)基平板中央即為指示菌平板。

1.2.2 拮抗菌株的篩選 。采用對(duì)峙培養(yǎng)的方法篩選拮抗菌株，將分離獲得的海洋放線菌、真菌和細(xì)菌接種于相應(yīng)的培養(yǎng)基平板上，28℃培養(yǎng)7d后，在有菌生長(zhǎng)處用打孔器取直徑6mm的菌餅，置于距離指示菌平板中心約3cm處，每皿成三角形放置3塊，以不放置待測(cè)菌株的指示菌平板作為對(duì)照。于28℃的微生物培養(yǎng)箱培養(yǎng)7d后，觀察抑菌帶的有無(wú)和寬度，據(jù)此判定微生物的拮抗活性[3]。

2 結(jié)果與分析

2.1 海洋微生物的分離

從浙江省大陳島周邊海域采集魚類、貝類、蝦類以及潮間帶的泥沙等樣品20份，進(jìn)行海洋微生物菌株分離。根據(jù)菌落生長(zhǎng)形態(tài)、大小、色澤等特點(diǎn)進(jìn)行重排，用肉眼觀察，從平板上挑取不同生長(zhǎng)特征的菌落進(jìn)行純培養(yǎng)，分離到形態(tài)特征各異的菌株共計(jì)57株。其中放線菌28株、真菌16株、細(xì)菌13株（表1）。

2.2 拮抗菌株的初篩

通過平板對(duì)峙培養(yǎng)試驗(yàn)，從分離獲得的微生物中篩選出4株對(duì)柑橘黑點(diǎn)病菌具有明顯拮抗活性的菌株（圖1所示）。4株菌均屬

表1 不同海洋生物樣品中分離的菌株數(shù)

圖1 拮抗柑橘黑點(diǎn)病菌的菌株

于放線菌，分離獲得的其他16株真菌和13細(xì)菌中未發(fā)現(xiàn)拮抗活性的菌株。

3 討論

海洋中有大量微生物資源，其低溫、高壓、高鹽的特殊環(huán)境為抗生素等多種代謝活性產(chǎn)物的產(chǎn)生提供了可能，海洋微生物資源的發(fā)利用前景廣闊，是當(dāng)前海洋學(xué)和微生物學(xué)研究的熱點(diǎn)[3]。海洋放線菌，尤其是鏈霉菌在海洋環(huán)境中分布廣泛，種類多樣，能產(chǎn)生多種抗生素類物質(zhì)，具有巨大的研究開發(fā)價(jià)值。

本研究從浙江省大陳島海域采集的海洋生物和泥沙等20份樣品中分離獲得了57株微生物菌株，經(jīng)初步測(cè)定得知其中有4株放線菌對(duì)柑橘黑點(diǎn)病菌具拮抗活性。本次研究結(jié)果表明臺(tái)州地區(qū)海洋環(huán)境中含有對(duì)柑橘病原菌具拮抗活性的微生物，可作為今后拮抗微生物獲取的重要來源。本研究測(cè)定4株放線菌對(duì)柑橘黑點(diǎn)病病菌均具有抑菌活性，那么這些菌株對(duì)其他植物病原菌是否有拮抗活性，以及其他分離的微生物對(duì)柑橘黑點(diǎn)病菌外的植物病原菌是否有拮抗活性，仍需進(jìn)一步研究確定。此外，對(duì)這些拮抗菌株的分類鑒定等也是接下來需要開展的工作。