侯澤豪，張迎新,2，王 歡，孫坤坤，方正武，馬東方，張改生，王書平

(1.長江大學 農學院/湖北省澇漬災害與濕地農業(yè)重點實驗室，湖北荊州 434025；2.中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所，北京 100101；3. 西北農林科技大學 農學院/小麥育種教育部工程研究中心，陜西楊凌 712100)

高溫脅迫是指植物體由于周圍生長環(huán)境溫度過高而引起的植物生理性傷害。近年來，隨著大氣中CO2和其他溫室氣體排放量的逐年升高，地球表面平均溫度也在日益增高，高溫脅迫給全球農業(yè)生產帶來了極大危害[1-2]。有關溫度變化對全球谷物供應的研究表明，大氣溫度的升高將會導致全球谷物大幅度減產[3-4]。因此，有關高溫脅迫對植物生長發(fā)育的影響也備受關注[2,5-6]。

葉綠體是進行光合作用的重要場所，而葉綠素是葉綠體的主要成分，也是植物進行光合作用的主要色素，其質量分數(shù)的多少更是衡量植物光合效率的重要生理指標之一，因此，對葉綠素的提取及質量分數(shù)的測定一直是植物生化研究的重要內容。研究已經(jīng)表明，葉綠素對溫度的變化最為敏感，其質量分數(shù)的多少則直接影響光合效率的強弱[7-9]。而高溫脅迫對不同植物葉綠素的影響也不盡相同，花生幼苗在高溫42 ℃處理過程中，葉綠素質量分數(shù)隨著處理時間的延長而下降，具體表現(xiàn)為初期下降幅度平緩，后期變化明顯[10]。而銀杏在45 ℃高溫脅迫下葉綠素質量分數(shù)則增加[11]。高溫脅迫下春小麥旗葉葉綠素質量分數(shù)從灌漿期到成熟期明顯降低[12]；因此，研究和揭示高溫脅迫下小麥花藥葉綠素質量分數(shù)的變化規(guī)律，將更有助于降低高溫對小麥葉綠素的破壞，確保小麥的高產和穩(wěn)產。

1,5-二核酸核酮糖羧化酶(RuBPcase)目前被認為是對溫度最敏感的光合酶，并且是決定C3植物光合碳代謝方向和效率的關鍵酶。研究表明，RuBPcase是高溫抑制卡爾文循環(huán)的主要發(fā)生位點。Nakano等[13]研究發(fā)現(xiàn)，溫度脅迫可能導致光合作用暗反應中CO2同化的關鍵酶RuBPcase的活性受到影響。黃瓜幼苗在高溫(42 ℃/32 ℃)脅迫下的RuBP羧化酶(RuBPCase)和Rubisco活化酶(RCA)活性及其mRNA表達量逐漸降低，而在亞高溫(35 ℃/25 ℃)下的脅迫初期變化不大，后期開始趨于降低[14]。玉米的成熟葉片和幼嫩葉片在高溫脅迫下RuBP羧化酶的活性則顯著降低[15]。而薛偉等[16]的研究發(fā)現(xiàn)，高溫脅迫使作物葉片RuBPcase的活性先增加后降低，最終造成光合性能下降，導致葉片衰老加速。而鮮見有關高溫脅迫下小麥花藥葉綠素質量分數(shù)、RuBP羧化酶活性及其基因表達的研究。

小麥的花藥壁中也存在大量的葉綠體，這些葉綠體能夠進行光合作用，其產物是花藥絨氈層、胼胝質生長和花粉粒發(fā)育的重要物質和能量來源之一[17]，一旦該生理過程發(fā)生紊亂，必然會導致雄性不育，進而造成花藥敗育甚至絕收。本研究以小麥不同發(fā)育時期的花藥為材料，比較分析高溫脅迫對小麥花藥葉綠素質量分數(shù)、RuBP羧化酶活性及其基因表達的影響，旨在揭示高溫脅迫下小麥花藥敗育過程中葉綠素質量分數(shù)的變化規(guī)律及光合碳代謝關鍵酶的響應過程，探索小麥高溫脅迫響應機制，對提高小麥的耐熱性具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料處理

供試小麥品種為‘西農1376’。待花藥發(fā)育至單核早期，于人工氣候室中進行高溫脅迫處理，設置溫度分別為(42±1) ℃(高溫脅迫處理) 和(25±1) ℃(對照),濕度為(70±5)%，每天處理3 h，共3 d，此時花藥已發(fā)育至單核后期。4 ℃分別收集單核后期、二核期、三核期的花藥，取樣時期的確定按Wang等[18-19]的方法進行。

1.2 穗部形態(tài)學觀察

采用數(shù)碼相機獲取小麥穗部圖像，新鮮收集的成熟花粉粒采用w=2% I2-KI染色，在顯微鏡下觀察并拍照。

1.3 葉綠素提取

葉綠素的提取參照李得孝等[20]的方法并略加修改，取0.25 g小麥花藥，立即置于浸提液[V(丙酮)∶V(乙醇)=1∶1]中，在25 ℃恒溫搖床(110 r/min，避光)下浸提18 h，經(jīng)過濾、洗滌后定容至25 mL，并立即在645 nm和663 nm波長下測定其吸光值。所得數(shù)據(jù)經(jīng)Amon法修正公式計算葉綠素質量分數(shù)[21]：

葉綠素a(mg/g)=(12.71×A663-2.59×A645)×V/W

葉綠素b(mg/g)=(22.88×A645-4.67×A663)×V/W

葉綠素總質量分數(shù)(mg/g)=(8.04×A663+20.29×A645)×V/W

式中：A663、A645分別為663 nm、645nm 波長下的吸光度，V為提取液的體積，W為花藥的鮮質量。

1.4 RuBP羧化酶提取及活性測定

RuBP 羧化酶的提取按萇建峰等[22]的方法進行，并略加修改。取小麥花藥0. 25 g(鮮質量) 置于預冷的研缽中，加入2 mL 預冷的100 mmol/L 的Tris-HCl 緩沖液[φ=10%甘油、w=1% PVP、1 mmol/L EDTA、7 mmol/L 巰基乙醇，pH 7.8]，冰浴中研磨，勻漿后于4 ℃下15 000 g 離心20 min,取上清液待測。RuBP 羧化酶酶活性參照魏愛麗等[23]的分光光度法進行測定。

1.5 熒光定量PCR分析

按照Trizol Reagent Kit(Invitrogen公司)的操作說明，提取總RNA。經(jīng)12 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質量后，依照反轉錄試劑盒PrimeScriptTMRT Reagent Kit(TaKaRa公司)的操作說明進行cDNA合成。熒光定量PCR采用SYBR Premix ExTaq試劑盒(TaKaRa公司)在CFX96RealTime PCR System上進行，按照試劑盒的說明進行操作。使用Actin基因作為內參基因，并利用2-△△Ct法計算相對表達量，所檢測基因和特異引物序列見表1。

1.6 統(tǒng)計分析

試驗設置3個生物學重復，每個重復進行3次測量。采用Microsoft Excel 2010進行數(shù)據(jù)整理，采用Origin 9.0軟件進行差異顯著性分析及繪制圖表。

表1 相關基因熒光定量PCR引物Table 1 Specific primers in this study

2 結果與分析

2.1 高溫脅迫誘導小麥產生雄性不育

對高溫脅迫后的植株觀察發(fā)現(xiàn)，散粉后，可育穗因自花授粉穎殼表現(xiàn)為閉合(圖1-A)，成熟花粉粒含有豐富的淀粉粒而被I2-KI溶液染成深藍色(圖1-C)。相反，高溫脅迫后的花藥細胞質稀薄，其花粉粒敗育比較徹底沒有淀粉積累(圖1-D)，且在沒有接授外源花粉的情況下，不育穗的穎殼保持張開狀態(tài)(圖1-B)。經(jīng)統(tǒng)計分析其雄性不育率均在98%～100%，飽和授粉結實率均在98%以上，表明高溫脅迫對子房的發(fā)育基本沒有影響，而對花藥是否可育起著決定性的作用。

A.對照組 Control；B.高溫處理組 High-temperature stress；C、D.成熟花粉粒I2-KI染色比較觀察 Comparison of matured pollen grain by I2-KI staining

圖1小麥形態(tài)學比較觀察
Fig.1Comparisonofmorphologicalfeaturesofwheatplants

2.2 高溫脅迫對小麥花藥葉綠素質量分數(shù)的影響

由圖2可知，高溫處理及對照的花藥葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素質量分數(shù)均隨發(fā)育時期呈持續(xù)下降的趨勢。正常發(fā)育的小麥花藥經(jīng)高溫脅迫后，其葉綠素a質量分數(shù)在單核后期、二核期和三核期分別顯著降低8.58%、23.87%和33.68%。與葉綠素a相比，葉綠素b對高溫脅迫更為敏感，在相應發(fā)育時期的降幅較大，分別比對照降低20.07%(單核后期)、39.81%(二核期)和44.91%(三核期)。這使得高溫脅迫下花藥總葉綠素質量分數(shù)較對照顯著降低12.55%(單核后期)、29.89%(二核期)和39.11%(三核期)。

2.3 高溫脅迫對花藥中RuBP羧化酶活性影響

RuBP羧化酶是光合作用中羧化階段的關鍵酶，其活力的高低直接決定著光合碳同化的速率。因此，對不同發(fā)育時期的小麥花藥的RuBP羧化酶活性進行分析(圖3)。結果顯示，RuBP羧化酶的活性與花藥的發(fā)育時期呈負相關，即隨花藥發(fā)育進程的推進而逐漸降低。與對照相比，高溫脅迫從單核后期開始顯著減低花藥中RuBP羧化酶的活性，為對照的73.53%。且隨著后期的發(fā)育而不斷加劇，二核期時是對照的65.62%。而在花藥發(fā)育至三核期時差異達到最大，僅是對照的52.05%。

“*”表示處理間的差異顯著，下同

“*”mean significant among treatments，the same below

圖2高溫脅迫對不同發(fā)育時期的花藥
葉綠素質量分數(shù)的比較分析
Fig.2Comparativeanalysisofchlorophyllmassfractionofantheratdifferentdevelopmentperiodsunderhightemperaturestress

圖3 高溫脅迫對不同發(fā)育時期花藥的RuBP羧化酶活性的比較分析Fig.3 Comparative analysis of activity of RuBPcase of anther at different development periods under high temperature stress

2.4 高溫脅迫對花藥中RuBP基因表達模式的分析

進一步采用熒光定量PCR技術檢測RuBP羧化酶的表達水平，結果表明，在整個花藥發(fā)育過程中，RuBP羧化酶的表達水平與其活性的變化趨勢保持一致，也隨發(fā)育時期的推進而下降，且高溫脅迫顯著減低RuBP羧化酶的表達水平(圖4)，分別比對照降低16.56%(單核后期)、35.48%(二核期)和56.56%(三核期)。

3 討 論

小麥在生殖生長階段，孢原細胞經(jīng)過平周分裂形成初生壁細胞和造孢細胞，造孢細胞進一步發(fā)育為小孢子母細胞，小孢子母細胞再經(jīng)2次減數(shù)分裂和2次有絲分裂形成有3個細胞構成的成熟花粉粒[18,24]。因此，成熟花粉粒的形成過程需要嚴格遵循細胞分裂周期的發(fā)育程序，一旦該程序被干擾，則會出現(xiàn)花粉敗育[18,25]。當外界環(huán)境溫度達到一定的閾值時，將有可能引起小麥花藥分裂周期的紊亂而產生敗育。本研究中，正常生長發(fā)育的小麥花藥，經(jīng)高溫脅迫后，小孢子發(fā)生徹底的敗育，且敗育效果穩(wěn)定，但子房仍能維持較高結實能力。這為非生物脅迫下小麥生殖生長、花粉發(fā)育的研究提供了理想的材料，也為研究作物耐熱性的分子遺傳基礎及提高作物的抗熱性提供了捷徑。s

圖4 小麥花藥中RuBPcase基因表達水平分析Fig.4 Comparative analysis of relative expression of RuBPcase gene of anther

葉綠素是植物體內葉綠體的重要組成成分，是植物光合作用中吸收光的主要色素，能將捕捉到的光能轉化為生物能，為植物生長發(fā)育提供所需的營養(yǎng)物質和能量。處于生殖發(fā)育時期的花藥，則需要更多的物質和能量來確保小孢子母細胞順利形成成熟花粉粒，而花藥壁中的葉綠體是這些物質和能量來源的重要器官之一[17]，因此葉綠素與雄性不育有著密切的關系。李冰等[26]以赤茄和栽培品種遠緣雜交選育得到的核質互作型雄性不育系‘052506’和其保持系‘052507’為材料，測定分析葉片葉綠素的質量分數(shù)，結果顯示不育系葉綠素質量分數(shù)幼苗期低于保持系，盛花期和保持系相近，結實期高于保持系。高國訓等[27]的研究結果認為在芹菜不育系的花器官中，葉綠素a和葉綠素b均低于其保持系。本研究中，在高溫脅迫的初期已經(jīng)對花藥的葉綠素合成系統(tǒng)產生影響，且與花藥的發(fā)育呈正相關，脅迫初期葉綠素a質量分數(shù)下降幅度小于葉綠素b，主要原因是葉綠素b對溫度更為敏感[28]。

在高等植物中，具有不同光合碳循環(huán)途徑的植物其碳同化受高溫的影響也各異，其中，CAM(景天酸代謝)植物對高溫最不敏感，C4植物對高溫有較高的抗性，而C3植物則對高溫極為敏感[29]。RuBP羧化酶/加氧酶是處于光合碳還原和光合碳氧化兩個方向相反但又相互連鎖的循環(huán)交叉點上，它對凈光合速率起著決定性的作用，也是光合碳同化的關鍵酶，一直以來是眾多學者研究的焦點[13]。本研究中，高溫脅迫導致了光合作用暗反應中的RuBP羧化/加氧酶的羧化效率受到影響，脅迫后花藥各個時期的RuBP羧化酶活性及表達水平均顯著降低(圖3和圖4)。過高的溫度會導致光合作用暗反應中的RuBP羧化/加氧酶的羧化效率下降進而導致凈光合速率下降，而下降到一定程度時，植物將失去自養(yǎng)能力[30]。這對于生殖器官花藥來說，則表現(xiàn)為敗育。