馮興華 牟建立 何澤寶

作者單位：浙江省臺(tái)州恩澤醫(yī)療中心（集團(tuán)）恩澤醫(yī)院感染科（臺(tái)州318050）

我國(guó)乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染已是嚴(yán)重公共衛(wèi)生問(wèn)題，臨床統(tǒng)計(jì)顯示，約25%～40%HBV感染者因肝臟反復(fù)發(fā)作慢性炎癥進(jìn)而發(fā)展為肝硬化或肝癌，但目前其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確[1]。肝臟炎癥以及慢性纖維化貫穿從HBV感染、慢性肝炎、肝硬化以至于肝癌過(guò)程中，然而目前既有的血清標(biāo)志物對(duì)于評(píng)估肝臟炎癥以及慢性纖維化程度準(zhǔn)確度較差，因此，尋找簡(jiǎn)單易行且敏感性及特異性均較高的檢測(cè)指標(biāo)作為研究熱點(diǎn)之一[2]。近年發(fā)現(xiàn)的微小RNA（micro RNA）是一類(lèi)具有調(diào)控基因表達(dá)的RNA分子，參與細(xì)胞增殖與凋亡等多種病理生理過(guò)程，其中microRNA-29已被證實(shí)與纖維化病變緊密相關(guān)且在肝臟細(xì)胞中表達(dá)最高[3]。然而目前microRNA-29在HBV感染慢性肝病診斷中的臨床研究報(bào)道尚不多見(jiàn)，且部分研究結(jié)果存在爭(zhēng)議。因此本研究對(duì)不同類(lèi)型HBV感染慢性肝病患者外周血microRNA-29的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，探討microRNA-29在評(píng)價(jià)HBV感染慢性肝病中的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年1月—2017年6月我院就診的170例HBV感染慢性肝病患者作為研究對(duì)象，其中男91例，女79例，平均年齡（52.9±12.4）歲，均簽訂知情同意書(shū)，本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)審核通過(guò)。入選標(biāo)準(zhǔn)：（1）慢性乙型肝炎診斷及輕、中、重度的臨床分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)與中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病學(xué)分會(huì)聯(lián)合修訂的《慢性乙型肝炎防治指南》（2010年）[4]以及《病毒性肝炎防治方案》（2000年）[5]；（2）肝癌（HCC）診斷依據(jù)第 4屆全國(guó)肝癌學(xué)術(shù)大會(huì)討論通過(guò)的原發(fā)性肝癌診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；（3）研究前半年內(nèi)未使用抗病毒治療或免疫調(diào)節(jié)劑；（4）臨床資料齊全。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）同時(shí)合并或重疊感染其他非HBV病毒性肝炎；（2）罹患藥物、酒精、化學(xué)物質(zhì)等因素引起的肝炎以及自身免疫性肝病；（3）罹患有嚴(yán)重心肺腎等重要器官功能不全；（4）罹患糖尿病合并癥或免疫缺陷性疾病。

1.2 分 組 本研究對(duì)象根據(jù)臨床診斷分為四組慢性 HBV 攜帶（hepatitis B virus carriers，ASC）組，35例；慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）組，80例，根據(jù)病情程度再分為三個(gè)亞組：輕度25例、中度30例、重度25例；乙型肝炎肝硬化（liver cirrhosis，LC）組，30 例；肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）組，25例；另選擇同期健康體檢者（healthy control，HC）30名作為健康對(duì)照組。以上各組在性別比、年齡、體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、既往內(nèi)科疾病史相比無(wú)顯著性差異（P 均>0.05），見(jiàn)表 1。

表1 各組研究對(duì)象一般情況比較

1.3 血清microRNA-29檢測(cè)

1.3.1 總RNA提取及鑒定 各組研究對(duì)象均在清晨空腹自肘靜脈采集5mL靜脈血，應(yīng)用Trizol試劑（購(gòu)自美國(guó)Norgen公司）提取樣本血清中的RNA，并保存于-70℃待檢。RNA完整性應(yīng)用1%變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)確定，RNA濃度和純度應(yīng)用NanoDrop ND1000檢測(cè)確定。

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) cDNA合成：總反應(yīng)體系為 20μL，包括 dNTP 2μL、1×RT Buffer 2μL、RT 特異引物 0.3μL、Total RNA 200μg 2.5U/μL、Poly A Polymerase 1μL、RT mix 1μL、無(wú) RNA 酶水補(bǔ)足至 20μL。反應(yīng)條件為：16℃，30min；42℃，40min；85℃，5min。

實(shí)時(shí)定量PCR：總反應(yīng)體系體積為10μL，包括：2×Master Mix 5μL、10μmol/L 的 PCR 特異引物 F 0.5μL、10μmol/L 的 PCR 特異引物 R 0.5μL、加水至8μl，混合離心后再加入 2μl已合成的 cDNA。microRNA-29的擴(kuò)增引物序列為：上游引物（F）：5’GCGCGCTAGCACCATTTG-3’，下游引物（R）：5’-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’，反應(yīng)條件為：95℃，2min；40 個(gè) PCR 循環(huán)（95℃，10s；60℃，40s）。

本研究檢測(cè)所用PCR熱循環(huán)儀購(gòu)自德國(guó)Eppendoff公司、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)ROCHE公司Indianapolis；反轉(zhuǎn)錄試劑及所用引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3.3 microRNA-29表達(dá)水平計(jì)算 microRNA-29表達(dá)Ct值（反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)）：△Ct=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因（其值越大，即表達(dá)量越低），△△Ct=△Ct試驗(yàn)組-△Ct對(duì)照組，目的基因表達(dá)量=2-△△Ct。

1.4 臨床生化及病毒指標(biāo)檢測(cè) 應(yīng)用生化自動(dòng)分析儀檢測(cè)血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）；應(yīng)用化學(xué)發(fā)光法測(cè)定甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）；采用雙抗體夾心法檢測(cè)乙型肝炎表面抗原（HBsAg）；采用熒光定量PCR檢測(cè)HBV DNA水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS21.0軟件，計(jì)量資料數(shù)值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采取ANOVA檢驗(yàn)，兩組組間比較采用SNK檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以百分率表示，采取χ2檢驗(yàn)。應(yīng)用Pearson相關(guān)分析血清microRNA-29表達(dá)水平與血清ALT、HBsAg、HBV DNA以及AFP水平的相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組血清microRNA-29表達(dá)水平比較 各組血清microRNA-29相對(duì)表達(dá)量存在差異，HC組及ASC組＞CHB組＞LC組＞HCC組（P均＜0.05）；在CHB組的三個(gè)亞組也存在差異，重度＞中度＞輕度（P均＜0.05），見(jiàn)表 2。

2.2 Pearson相關(guān)分析 應(yīng)用Pearson相關(guān)分析，CHB組與LC組患者血清microRNA-29相對(duì)表達(dá)量與血清HBV DNA以及HBsAg水平呈負(fù)性相關(guān)（P均＜0.05）；HCC組患者血清microRNA-29相對(duì)表達(dá)量與AFP血清水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.817，P=0.013）；ASC組、CHB組、LC組及HCC組血清microRNA-29相對(duì)表達(dá)量與血清ALT水平均無(wú)相關(guān)關(guān)系（P均＞0.05），見(jiàn)表 3。

表2 各組血清microRNA-29表達(dá)水平比較（±s）

表2 各組血清microRNA-29表達(dá)水平比較（±s）

組別ASC組CHB組重度中度輕度LC組HCC組HC組F值P值例數(shù)35 80 25 30 25 30 25 30 Ct 16.2±1.5 19.2±2.1 17.4±1.6 18.7±2.2 19.9±2.3 24.5±2.7 26.8±2.0 15.6±1.8 4.887 0.035 2-△△Ct 38.6±4.8 21.1±3.6 23.6±3.2 21.6±2.9 19.2±3.8 8.7±2.1 3.5±1.4 40.5±3.5 6.053 0.001

表3 各組血清microRNA-29水平與不同臨床指標(biāo)Pearson相關(guān)分析

3 討論

研究[7]發(fā)現(xiàn)，microRNA在HBV感染慢性肝病患者體內(nèi)的病毒復(fù)制、肝纖維化進(jìn)展以及肝癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移機(jī)制中可能起重要調(diào)節(jié)作用，與慢性肝病發(fā)生、發(fā)展、治療及預(yù)后之間存在密切相關(guān)性。研究證實(shí)，肝臟組織細(xì)胞以及循環(huán)血液中均能檢測(cè)出microRNA，其中血清microRNA-29水平已被證實(shí)是一種非侵入性肝特異性診斷標(biāo)志物，能用于慢性肝病的早期診斷、分期、監(jiān)測(cè)以及預(yù)后判斷，包括評(píng)估病毒感染程度、纖維化程度、肝癌發(fā)生等[8-9]。

慢性HBV感染可導(dǎo)致microRNA-29的表達(dá)水平降低，且與慢性持續(xù)性感染和疾病進(jìn)展有負(fù)相關(guān)性，提示其可能作為保護(hù)因子抑制慢性肝病病情的發(fā)展[10]。研究[11-12]證實(shí)，血清 microRNA-29在 HBV 感染慢性肝病和肝癌患者中均降低，被認(rèn)為作為肝組織損傷標(biāo)志物具有較好的敏感性和特異。在人肝星狀細(xì)胞中轉(zhuǎn)染microRNA-29b研究中顯示，其能明顯減輕TGF-β1刺激引起的膠原蛋白I mRNA和蛋白的表達(dá)水平，提示microRNA-29b具有抗纖維化作用[13-14]。因此，有研究者認(rèn)為，探討HBV感染慢性肝病患者體內(nèi)血清microRNA-29水平的變化規(guī)律，不僅有助于進(jìn)一步闡明慢性HBV感染的機(jī)制，而且為臨床早期診斷和抗病毒治療療效評(píng)價(jià)提供新的分子標(biāo)記物[15-16]。

本研究發(fā)現(xiàn)，microRNA-29表達(dá)水平在健康對(duì)照組和慢性HBV攜帶者最高，慢性乙肝患者次之，肝硬化患者低于慢性乙肝患者，肝癌患者最低，同時(shí)慢性乙肝患者中隨著病情加重microRNA-29表達(dá)水平也在逐步降低，這說(shuō)明HBV感染慢性肝病患者血清microRNA-29水平已經(jīng)較正常人群降低，而隨著HBV感染從慢性乙肝向肝硬化失代償期以及肝癌的進(jìn)展過(guò)程中，外周血microRNA-29水平呈現(xiàn)逐步降低，提示microRNA-29可能作為抑癌基因參與慢性乙肝向肝硬化以及肝癌發(fā)展整個(gè)病理過(guò)程。

本研究結(jié)果顯示，血清microRNA-29表達(dá)水平與HBV DNA血清水平呈正相關(guān)，隨著慢性乙肝患者病情加重，血清microRNA-29表達(dá)水平降低，病毒復(fù)制加劇，病毒載量水平會(huì)有不同程度提高。同時(shí)慢性乙肝患者血清HBsAg的水平與血清microRNA-29表達(dá)水平也呈負(fù)相關(guān)，血清HBsAg水平己被證實(shí)與慢性肝病的進(jìn)展相關(guān)，因此血清microRNA-29對(duì)慢性乙肝患者病情進(jìn)展有抑制作用，并能評(píng)估病情嚴(yán)重程度。本研究結(jié)果顯示，肝癌患者血清microRNA-29相對(duì)表達(dá)量與AFP血清水平呈負(fù)相關(guān)，提示高血清AFP水平可能是肝癌組織microRNA-29低表達(dá)的體現(xiàn)，這對(duì)評(píng)估肝癌治療療效及預(yù)后評(píng)價(jià)有重要意義。ASC組、CHB組、LC組及HCC組血清microRNA-29相對(duì)表達(dá)量與血清ALT水平均無(wú)相關(guān)關(guān)系，這也提示肝功能水平影響因素較多，不能直接體現(xiàn)HBV感染慢性肝病患者病情進(jìn)展情況。

綜上所述，microRNA-29是一種肝臟特異性miRNA，與HBV DNA、HBsAg以及AFP有顯著負(fù)相關(guān)性，提示microRNA-29能對(duì)HBV感染慢性肝病炎癥程度以及肝癌的病情進(jìn)行評(píng)估，可能是一種具有臨床潛在應(yīng)用價(jià)值的肝臟損傷標(biāo)志物。