姜宣羽 王思為 樓麗君 鐘松陽 胡澤富

順鉑是已知最有效的抗腫瘤化療藥物之一[1]，然而其化療卻存在著多種嚴(yán)重不良反應(yīng)，以腎毒性最為明顯，其發(fā)生率高達(dá)30%以上[2]。研究[3]表明，順鉑化療腎毒性是影響其抗腫瘤療效的主要因素。因此降低順鉑化療腎毒性，是目前亟需解決的問題。順鉑為重金屬絡(luò)合物，其產(chǎn)生腎毒性的原理與重金屬腎病相類似，因此一些防治重金屬中毒的傳統(tǒng)中藥可能對順鉑腎毒性有療效。土茯苓為百合科植物光葉菝葜Smilax glabra Roxb.的干燥根莖，味甘淡，性平，歸肝、胃經(jīng)，具有健脾胃、解毒化瘀之功效，它也是我國古代治療重金屬中毒的傳統(tǒng)中藥，其主要活性成分為落新婦苷[4]。研究[5-6]表明，土茯苓中黃酮類化合物具有螯合重金屬離子，改善重金屬腎損傷的作用。因此，我們推測土茯苓中黃酮類化合物可能具有改善順鉑腎損傷的作用。本研究擬探討土茯苓活性分子落新婦苷對重金屬藥物順鉑誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞HK-2凋亡的影響，并初步明確其機(jī)制，為土茯苓改善順鉑腎毒性作用研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 材 料 人腎小管上皮細(xì)胞HK-2，購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.2 藥 物 落新婦苷（來源于土茯苓，HPLC≥98%，上海源葉生物科技有限公司，批號R1806F4659）；順鉑注射液（江蘇豪森藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號160902）。

1.3 主要試劑 MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒（博士德生物，貨號09I26C56）；AnnexinV-FITC流式細(xì)胞凋亡試劑盒（Biolegend，貨號640914）；cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo Scientific）；QPCR試劑（上海生工）；bcl-2抗體（CST，貨號 4223）；Bax抗體（CST，貨號 5023）；cleaved-caspase-3 抗體（CST，貨號 9661）；OCT2抗體（Abcam，貨號 ab179808）。

1.4 主要儀器 FC-500流式細(xì)胞儀，美國Beckman Coulter；MR-4100 型酶標(biāo)儀，美國 Dynatech；高速冷凍離心機(jī)，美國Thermo；LC480熒光定量PCR儀，美國羅氏；4200SF凝膠成像儀，上海Tanon；ECLIPSE Ti-S倒置顯微鏡，日本Nikon。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人腎小管上皮細(xì)胞HK-2細(xì)胞復(fù)蘇后，培養(yǎng)于含10%胎牛血清，1%雙抗的DMEM：F12（1:1）培養(yǎng)基中，置于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱，生長密度達(dá)80%后，用胰蛋白酶消化，1:3傳代培養(yǎng)。選取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 MTT檢測細(xì)胞活力 將HK-2細(xì)胞用PBS洗滌2次后，胰酶消化，收集細(xì)胞，500g 4℃離心3min后棄去上清液，用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并使待測細(xì)胞密度為1000～10 000/孔，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100μL，并置于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后換含有落新婦苷濃度為 30、50、100、200、300μM和順鉑50μM的培養(yǎng)基，每個(gè)濃度設(shè)6孔。培養(yǎng)24h后每孔加入10μL MTT染色液，于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4h。后每孔加入100μL Formanzan溶解液，置于搖床上振蕩30min，至結(jié)晶全部溶解，放入酶標(biāo)儀（波長490nm）測吸光值。

2.3 流式細(xì)胞凋亡檢測 取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于6孔板中，分為四組，即對照組、順鉑組、落新婦苷低、高劑量組。待細(xì)胞生長至密度為80%左右后，加入不同藥物。對照組為正常培養(yǎng)基，順鉑組加入含有濃度為50μM順鉑的培養(yǎng)基，落新婦苷低劑量組加入含有50μM順鉑和100μM落新婦苷的培養(yǎng)基，落新婦苷高劑量組加入含有50μM順鉑和200μM落新婦苷的培養(yǎng)基。培養(yǎng)24h后，用PBS洗滌2次，不含EDTA的胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞于EP管，400g 4℃離心3min，棄去上清液，加入200μL Binding-buffer懸浮細(xì)胞，后分別加入5μL Annexin-FITC和10μL Propidium-Iodide混勻，室溫避光反應(yīng)10min。最后再加入300μL Binding-buffer，上流式細(xì)胞儀檢測分析?？偟蛲?=早期凋亡%+晚期凋亡%。

2.4 RT-PCR檢測 藥物處理方法和分組同2.3。采用Trizol法提取各組細(xì)胞RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照SYBR Green熒光染料法進(jìn)行定量PCR測定，引物由金唯智公司合成，引物序列如下：OCT2上游引物：5'-CATCGTCACCGAGTTTAACCTG-3'，下游引物 ：5'-AGCCGATACTCATAGAGCCAAT-3'；β -actin上游引物：5'-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3'，下游 引 物 ：5'-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3'。PCR反應(yīng)條件：95℃ 30s 1循環(huán)，95℃ 5s 40循環(huán)，60℃31s 40循環(huán)，采用2-ΔΔCt法進(jìn)行半定量分析。

2.5 Western blot檢測 藥物處理方法和分組同2.3。細(xì)胞用預(yù)冷的PBS洗滌2次后，加入RIPA細(xì)胞裂解液，冰上裂解10min后用細(xì)胞刮刀刮下，收集于EP 管 ，100℃ 煮 10min 后 16 000r/min，4℃ 離 心10min，取上清液。每組取20μL進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，1%casin封閉1h后加入相應(yīng)的一抗（bax 1:1000，bcl-2 1:1000，cleaved-Caspase-3 1:1000，OCT2 1:500，β-actin 1:3000），孵育過夜。TBST洗膜5min×4次，與相應(yīng)的二抗室溫孵育1h后，TBST洗膜5min×4次，后用ECL顯色液顯色，置于凝膠成像儀上拍攝。使用ImageJ軟件分析蛋白條帶灰度值，將目的蛋白灰度值除以內(nèi)參蛋白灰度值，得到目的蛋白相對表達(dá)量。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以（±s）表示，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 落新婦苷對順鉑誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞活力的影響結(jié)果顯示，50μM順鉑能夠顯著抑制HK-2細(xì)胞活力（P＜0.01）；落新婦苷具有促進(jìn)順鉑誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞活力的作用，且隨著其藥物濃度的增加作用越明顯，尤其 200μM 劑量顯著（P＜0.01）。見表 1。

3.2 落新婦苷對順鉑誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞凋亡的影響流式細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，順鉑組細(xì)胞凋亡率顯著增加（P＜0.01）；與順鉑組比較，落新婦苷能夠顯著降低HK-2細(xì)胞凋亡，尤其200μM劑量組顯著（P＜0.01），見封四圖 1、表 2。

表1 不同濃度落新婦苷對順鉑誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞活力的影響（±s）

表1 不同濃度落新婦苷對順鉑誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞活力的影響（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.01；與順鉑組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別對照組順鉑組孔數(shù) 落新婦苷（μM）--3 0落新婦苷組6 6 6 6 6 6 6順鉑（μM）-50 50 50 50 50 50 50 100 200 300 OD值（490nm）1.42±0.15 0.96±0.13*1.01±0.11 1.07±0.12 1.15±0.14△1.20±0.13△△1.16±0.17△

表2 各組細(xì)胞總凋亡率比較（%，±s）

表2 各組細(xì)胞總凋亡率比較（%，±s）

注：與對照組比較，*P＜0.01；與順鉑組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別對照組順鉑組落新婦苷組孔數(shù) 落新婦苷（μM）6 6 6 6順鉑（μM）-50 50 50--100 200總凋亡率1.20±1.13 61.51±5.67*37.01±6.32△33.52±6.93△△

3.3 落新婦苷對順鉑誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、cleaved-caspase-3 蛋白表達(dá)量的影響與對照組比較，順鉑組細(xì)胞Bax、cleaved-caspase-3表達(dá)量顯著增加（P＜0.01），Bcl-2表達(dá)量顯著減少（P＜0.01）；與順鉑組比較，落新婦苷能夠顯著下調(diào)Bax、cleaved-caspase-3 蛋白表達(dá) （P＜0.05 或 P＜0.01），上調(diào) Bcl-2 蛋白表達(dá)（P＜0.05）。見封四圖 2、表3。

3.4 落新婦苷對順鉑誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白OCT2 mRNA表達(dá)的影響 與順鉑組比較，落新婦苷能夠顯著抑制HK-2細(xì)胞藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白OCT2 mRNA（P＜0.01）和蛋白質(zhì)（P＜0.05，P＜0.01）表達(dá)，見封四圖 3、表 4。

4 討論

順鉑抗腫瘤作用的機(jī)制主要是通過形成鉑-DNA絡(luò)合物，抑制癌細(xì)胞的DNA復(fù)制過程，并損傷細(xì)胞膜上結(jié)構(gòu)，從而產(chǎn)生細(xì)胞毒性[7]，但這也是其產(chǎn)生腎毒性的重要原因。研究[8]表明，線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性途徑、死亡受體介導(dǎo)的外源性途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑是順鉑引起腎小管細(xì)胞凋亡主要途徑。Bax和Bcl-2是調(diào)控線粒體凋亡途徑的主要基因，其比值對細(xì)胞凋亡的發(fā)生具有決定性作用，而caspase-3是caspase家族蛋白酶的重要組成部分，是凋亡途徑中的關(guān)鍵啟動因子[9]。研究[3]表明，順鉑能夠誘導(dǎo)bax易位到線粒體，促進(jìn)細(xì)胞色素c釋放，從而進(jìn)一步剪切caspase-3，最終導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果表明，落新婦苷能夠顯著下調(diào)Bax、cleaved-caspase-3，上調(diào)bcl-2蛋白表達(dá)抑制順鉑誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞凋亡。

表3 各組Bax、Bcl-2、cleaved-caspase-3蛋白質(zhì)相對表達(dá)量比較（±s）

表3 各組Bax、Bcl-2、cleaved-caspase-3蛋白質(zhì)相對表達(dá)量比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.01；與順鉑組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別對照組順鉑組落新婦苷組孔數(shù)3 3 3順鉑（μM）-50 50 50落新婦苷（μM）--100 200 Bax表達(dá)量0.02±0.01 0.33±0.07*0.19±0.04△0.18±0.02△Bcl-2表達(dá)量0.63±0.07 0.11±0.02*0.26±0.04△0.28±0.04△cleaved-caspase-3表達(dá)量0.08±0.03 0.54±0.06*0.28±0.06△△0.20±0.05△△

表4 落新婦苷對順鉑誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白OCT2表達(dá)的影響（±s）

表4 落新婦苷對順鉑誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白OCT2表達(dá)的影響（±s）

注：與順鉑組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別對照組順鉑組落新婦苷組孔數(shù) 落新婦苷（μM）3 3 3順鉑（μM）-50 50 50--100 200 OCT2 mRNA表達(dá)量1.01±0.11 0.89±0.09 0.53±0.14△△0.47±0.03△△OCT2蛋白質(zhì)表達(dá)量0.58±0.05 0.52±0.05 0.36±0.08△0.25±0.03△△

中醫(yī)認(rèn)為，順鉑腎毒性屬“藥毒”范疇，其根本病機(jī)為正虛邪盛。順鉑之毒壅積于腎，留聚膀胱，耗傷腎氣?！熬珰鈯Z則虛”，腎氣不固，腎精失藏，開合失司，乃至陰精外泄，濁邪內(nèi)聚[10]。治療順鉑腎毒性主要以扶正祛邪為治則，采用健脾益腎、活血利水、解毒化瘀等方法[10]。同樣現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究顯示，順鉑在腎臟的蓄積是其產(chǎn)生腎毒性的基礎(chǔ)。順鉑在腎臟的排泄過程中，藥物被濃縮，腎臟內(nèi)高濃度的順鉑被腎小管上皮攝取進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，順鉑通過與DNA結(jié)合引起腎細(xì)胞DNA損傷，并誘導(dǎo)其凋亡[8]。因此，減少腎細(xì)胞攝取順鉑或促進(jìn)順鉑排泄是防治順鉑腎毒性最有效的方法。

腎臟中存在大量藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，如有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體（OATs、MRPs、ABCG2和 GLUT9等）和有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)體（OCTs、OCTNs、MATEs和 MDR1等），它們在藥物的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和排泄中起到了關(guān)鍵的作用[11-12]。OCT2即有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)體2，它可將血液中多種陽離子物質(zhì)（如尿酸，重金屬離子等）轉(zhuǎn)入腎小管上皮細(xì)胞中[13]。臨床研究[15]顯示，順鉑化療后藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白OCT2基因突變患者腎毒性發(fā)生率顯著低于野生型患者，這可能是由于OCT2缺失導(dǎo)致轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入腎小管細(xì)胞的順鉑量減少引起的。實(shí)驗(yàn)[16]研究也證實(shí)，腎小管上皮細(xì)胞經(jīng)OCT2基因敲除后，其攝取鉑離子的能力顯著降低。本研究結(jié)果顯示，落新婦苷能夠顯著降低順鉑誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞OCT2 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)（P＜0.05，P＜0.01），提示落新婦苷抗順鉑誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞凋亡的作用可能與其抑制OCT2的作用有關(guān)。

綜上所述，土茯苓活性分子落新婦苷具有抑制順鉑誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞凋亡的作用，其機(jī)制可能與下調(diào)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白OCT2表達(dá)有關(guān)。