魏喬　盛雅倩　茹松偉

【摘要】 目的：觀察眼鏡蛇毒因子（cobra venom factor，CVF）對膿毒癥大鼠外周血中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）和白介素-10（IL-10）的影響。方法：選取清潔級雄性SD大鼠144只，按照隨機數(shù)字表法將大鼠分為A組（假手術(shù)組）、B組（膿毒癥組）、C組（CVF預(yù)處理組），各48只；各組按照標本采集點的不同又分為術(shù)后2、4、8、12、16、24 h六個時間點亞組，各8只。B、C組采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)（CLP）制作膿毒癥大鼠模型；C組大鼠在CLP術(shù)前靜脈注射CVF，而A、B組靜脈注射等量0.9%氯化鈉溶液。觀察術(shù)后大鼠一般情況及腹腔情況，比較各組術(shù)后不同時間點的TNF-α、IL-6和IL-10水平變化。結(jié)果：C組大鼠膿毒癥反應(yīng)較B組明顯減輕；除術(shù)后8 h外，C組術(shù)后其他時間點TNF-α水平均低于B組（P<0.05），其中B組術(shù)后2 h時TNF-α迅速升高達峰然后下降，但是術(shù)后12 h再次升高出現(xiàn)第二個峰值，C組術(shù)后4 h較2 h迅速下降，術(shù)后8 h再次升高出現(xiàn)第二個峰值；除術(shù)后16 h外，C組術(shù)后其他時間IL-6水平均低于B組（P<0.01）；除術(shù)后2、24 h外，C組血清IL-10水平均高于B組（P<0.05），而且術(shù)后8、16 h兩次達到峰值，呈雙峰變化。結(jié)論：CVF可以有效維持促炎細胞因子（TNF-α、IL-6）和抗炎細胞因子（IL-10）的平衡并明顯抑制膿毒癥大鼠的炎癥反應(yīng)，同時TNF-α及IL-10的“雙峰現(xiàn)象”也為免疫平衡理論及PICS提供了理論依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】 膿毒癥； 補體； 眼鏡蛇毒因子； 細胞因子

Effect of Cobra Venom Factor in Inhibiting Complement Activation on Serum Cytokines in Septic Rats/WEI Qiao，SHENG Yaqian，RU Songwei，et al.//Medical Innovation of China，2018，15（23）：0-035

【Abstract】 Objective：To observe the effect of cobra venom factor（CVF） on TNF-α，IL-6 and IL-10 in peripheral blood of septic rats.Method：A total of 144 male SD rats with clean grade were selected.According to the random number table method，rats were divided into group A（sham operation group），group B（sepsis group） and group C（CVF pretreatment group），48 cases in each group.According to the different collection points，each group was divided into six subgroups（after operation 2，4，8，12，16，24 h），8 cases in each subgroup.The sepsis rats were induced by cecal ligation and puncture（CLP） in group B and C，and the rats of group C received intravenous injection of CVF before CLP，while those of group A and B received equal amount of normal saline intravenously.The general condition and abdominal cavity condition of rats after operation were observed，and the levels of TNF-α，IL-6 and IL-10 at different time points after operation in each group were compared.

Result：The manifestations of sepsis in group C were less severe than those of group B.Except for 8 h after operation，the levels of TNF-αin group C were lower than those of group B（P<0.05）.The levels of TNF-α in group B increased rapidly to peak at 2 h，and then decreased，but increased again to the second peak at 12 h，and the levels of TNF-α in group C decreased rapidly at 4 h compared with 2 h and increased again to the second peak at 8 h.Except for 16 h after operation，the levels of IL-6 in group C were lower than those of group B（P<0.01）.Except for 2 and 24 h after operation，the levels of serum IL-10 in group C were higher than those of group B（P<0.05），and peaked at 8 h and 16 h after operation，which showed bimodal changes.Conclusion：CVF can effectively maintain the balance of pro-inflammatory cytokines（TNF-α，IL-6） and anti-inflammatory cytokine（IL-10），and obviously inhibit the inflammatory response of sepsis rats.The bimodal phenomenon of TNF-α and IL-10 also provides a theoretical basis for the theory of immune balance and PICS.

【Key words】 Sepsis； Complement； Cobra venom factor； Cytokines

First-authors address：The First Affiliated Hospital of Xiamen University，Xiamen 361003，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.23.008

膿毒癥以細胞因子及炎癥介質(zhì)的過度釋放為特征[1]，現(xiàn)在越來越多的研究表明補體系統(tǒng)失控性的過度激活可能是膿毒癥發(fā)病機制的關(guān)鍵因素之一[2]。補體系統(tǒng)過度激活產(chǎn)生的大量過敏毒素（C3a、C4a和C5a）可激活單核巨噬細胞及中性粒細胞迅速產(chǎn)生大量的炎癥介質(zhì)從而進一步介導(dǎo)并加重機體的傷害[3-4]。因此抑制補體激活成為膿毒癥救治的一個方向和突破口[5-6]。眼鏡蛇毒因子（cobra venom factor，CVF）是一款經(jīng)典的補體抑制劑，利用其可導(dǎo)致補體耗竭而發(fā)揮抑制補體激活的作用。本研究通過盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)（cecal ligation and puncture，CLP）制作膿毒癥大鼠模型，通過觀察膿毒癥大鼠早期外周血促炎細胞因子中的腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）和抗炎細胞因子白介素-10（IL-10）

等細胞因子的變化，并結(jié)合大鼠一般情況及腹腔情況，進一步探討眼鏡蛇毒因子對膿毒癥大鼠的作用。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 清潔級SD大鼠144只，雄性，每只體重250～300 g（江西中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物合格證號：JZDWNO：2006-108、JZDWNO：2007-031）。按照隨機數(shù)字表法將大鼠分為A組（假手術(shù)組）、B組（膿毒癥組）、C組（CVF預(yù)處理組），各48只；各組按照標本采集點的不同又分為術(shù)后2、4、8、12、16、24 h六個時間點亞組，各8只。A組僅開腹翻動盲腸后關(guān)腹；B、C組大鼠開腹后均參照文獻[7]行CLP制作膿毒癥模型；C組于術(shù)前24 h按50 μg/kg經(jīng)陰莖背靜脈注射CVF，A、B組則給予等劑量的0.9%氯化鈉溶液。術(shù)后置籠內(nèi)自由活動，不禁飲食。

1.2 細胞因子的測定 TNF-α和IL-6含量采用放射免疫分析法測定，藥盒購自北京華英生物技術(shù)研究所。IL-10含量采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法測定，藥盒購自美國R&D;公司。觀察術(shù)后不同時間點TNF-α、IL-6、IL-10的變化。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 使用SPSS 22.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用（x±s）表示，多組間比較采用F檢驗，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠CVF術(shù)后一般情況及腹腔觀察 B組大鼠隨時間延長可見精神逐漸萎靡，呼吸急促逐漸加重，反應(yīng)逐漸遲鈍，活動逐漸減少，龜縮在一角，極其容易捕捉，豎毛現(xiàn)象逐漸明顯；腹腔滲液顏色逐漸由淡紅色清亮狀逐漸變?yōu)楹稚珳啙釥?，腸粘連現(xiàn)象逐漸明顯。而C組大鼠膿毒癥反應(yīng)較B組明顯減輕。

2.2 三組術(shù)后血清TNF-α水平變化比較 除術(shù)后8 h外，A、C組術(shù)后其他時間TNF-α水平均低于B組（P<0.05）；術(shù)后4 h，C組TNF-α水平低于A組（P<0.05）；另外B組術(shù)后2 h時TNF-α迅速升高達峰，然后下降，但是術(shù)后12 h再次升高出現(xiàn)第二個峰值；C組也有相似的雙峰變化趨勢，術(shù)后

4 h時較術(shù)后2 h時迅速下降，術(shù)后8 h時再次升高出現(xiàn)第二個峰值。見表1、圖1。

2.3 三組術(shù)后血清IL-6水平變化比較 A組術(shù)后各時間點IL-6水平均低于B組（P<0.01）；除術(shù)后16 h外，C組術(shù)后其他時間IL-6水平均低于B組（P<0.01）；除術(shù)后12 h外，C組術(shù)后其他時間IL-6水平均高于A組（P<0.05）；另外三組術(shù)后4 h達峰后均逐漸下降，其中C組介于A、B組間，明顯高于A組（術(shù)后12 h除外），但明顯低于B組（術(shù)后16 h除外）。見圖2、表2。

2.4 三組術(shù)后血清IL-10水平變化比較 術(shù)后8、12、16 h，C組血清IL-10水平均高于A、B組（P<0.05），且術(shù) 后4 h，C組血清IL-10水平均高于B組（P<0.05）；B組血清IL-10水平一直處于較低水平，各時間點沒有明顯變化；C組血清IL-10分別于術(shù)后8、16 h兩次達到峰值，呈雙峰變化。見表3、圖3。

3 討論

作為機體免疫系統(tǒng)的一個非常重要的組成部分，補體系統(tǒng)的適度激活是宿主防御反應(yīng)的一個重要方面[8]，但當(dāng)膿毒癥時局限性補體激活變?yōu)槿硇詴r，結(jié)果常常就不是有益的了[9-10]。由于認識到膿毒癥時補體系統(tǒng)過度激活會對機體造成巨大有害影響，因此許多學(xué)者嘗試通過特異性抑制物抑制補體激活從而保護機體[11-12]。Wang等[6]在靈長類膿毒癥模型上注射C1抑制物（C1-INH）后可以改善血流動力學(xué)、血液學(xué)反應(yīng)和存活率。魏永軍等[13]研究表明，在制作創(chuàng)傷失血性休克大鼠模型前提前使用CVF預(yù)處理可以有效降低內(nèi)毒素含量，并可以明顯改善預(yù)后。本研究顯示，除術(shù)后8 h外，A、C組術(shù)后其他時間TNF-α水平均低于B組（P<0.05）；術(shù)后4 h，C組TNF-α水平低于A組（P<0.05）；除術(shù)后16 h外，C組術(shù)后其他時間IL-6水平均低于B組（P<0.01）；術(shù)后8、12、16 h，C組血清IL-10水平均高于A、B組（P<0.05），且術(shù)后4 h，C組血清IL-10水平均高于B組（P<0.05）。結(jié)果提示，CVF預(yù)處理不僅可以明顯降低膿毒癥大鼠TNF-α、IL-6水平，而且可以明顯提高IL-10水平。同時，大鼠的一般表現(xiàn)及腹腔情況變化也印證了CVF可以明顯減輕大鼠的炎癥反應(yīng)。因此，CVF抑制補體激活后可以維持膿毒癥大鼠早期促炎和抗炎細胞因子的平衡，有效地減輕了大鼠的全身炎癥反應(yīng)。

另外本研究發(fā)現(xiàn)B組大鼠CLP術(shù)后TNF-α立即呈爆發(fā)性升高，隨后下降后再次升高達峰，呈現(xiàn)“雙峰現(xiàn)象”，C組也有相似的變化趨勢。本研究中發(fā)現(xiàn)的TNF-α的“雙峰現(xiàn)象”與以往其他學(xué)者的報道不盡相同，究其原因可能是：（1）血循環(huán)與局部組織的TNF-α水平不一致。翟紅霞等[14]研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥時局部組織與血循環(huán)的TNF-α水平不一致，局部組織遠遠高于血循環(huán)，局部組織的細胞因子有可能后期釋放入了血循環(huán)進而導(dǎo)致雙峰。

（2）各臟器組織TNF-α表達先后不一致。隰建成等[15]研究發(fā)現(xiàn)大鼠CLP后受損組織和外周血的中性粒細胞的TNF-αmRNA的表達量明顯增高，另外各臟器組織表達增高的先后順序也不相同，首先是受損局部的創(chuàng)傷組織，比如本實驗中穿孔的盲腸，接著是血循環(huán)，最后是肺和肝組織。（3）另外也有學(xué)者研究表明，有可能第一峰源于應(yīng)激，隨著進展大量細菌或毒素進入了循環(huán)，而第二峰源于感染，體內(nèi)的單核巨噬細胞可能對致炎物質(zhì)產(chǎn)生反應(yīng)導(dǎo)致形成了第二峰[16-19]。另外C組IL-10也能夠緊隨TNF-α的變化而變化，同樣呈現(xiàn)“雙峰現(xiàn)象”，顯示出良好的反應(yīng)性和隨動性。雖然TNF-α及IL-10

“雙峰現(xiàn)象”的具體的機制及意義有待進一步研究，不過卻提示膿毒癥時機體的免疫狀態(tài)是在不斷地發(fā)生變化的，不是一成不變地處于過度炎癥反應(yīng)或者免疫抑制狀態(tài)，這有力地支持了PICS[20]。這也為部分膿毒癥臨床實驗采取抑制炎癥反應(yīng)卻療效不佳提供了較為合理的解釋[21-22]，從而為免疫治療介入的時機以及免疫平衡理論提供了理論依據(jù)[23-24]。

綜上所述，CVF可以有效維持促炎細胞因子（TNF-α、IL-6）和抗炎細胞因子（IL-10）的平衡并明顯抑制膿毒癥大鼠的炎癥反應(yīng)，同時TNF-α及IL-10的“雙峰現(xiàn)象”也為免疫平衡理論及PICS提供了理論依據(jù)。

參考文獻

[1] Popbegan V，P?unescu V，Grigorean V，et al.Molecular mechanisms in the pathogenesis of sepsis[J].J Med Life，2014，7（Spec Iss 2）：38-41.

[2] Ward P A.In Sepsis，Complement Is Alive and Well[J].Crit Care Med，2016，44（5）：1026-1027.

[3] Haas P J，Strijp J V.AnaphylatoxinsTheir role in bacterial infection and inflammation[J].Immunol Res，2007，37（3）：161-175.

[4] Guo R F，Ward P A.Role of C5a in inflammatory responses[J].Annu Rev Immunol，2005，23（1）：821-852.

[5] Liu D，Cai S，Gu X，et al.C1 inhibitor prevents endotoxin shock via a direct interaction with lipopolysaccharide[J].J Immunol，2003，171（5）：2594-2601.

[6] Wang W，Okamoto K，Jacobs D O.Complement activation alters myocellular sodium homeostasis during polymicrobial sepsis[J].Crit Care Med，2002，30（3）：684-691.

[7]朱雪琦，劉清泉，姚詠明.膿毒癥動物模型制備方法的研究進展[J].中國危重病急救醫(yī)學(xué)，2006，18（2）：114-116.

[8] Wiersinga W J，Leopold S J，Cranendonk D R，et al.Host innate immune responses to sepsis[J].Virulence，2014，5（1）：36-44.

[9] Kemper C，Atkinson J P.T-cell regulation：with complements from innate immunity[J].Nat Rev Immunol，2007，7（1）：9-18.

[10] Robertson N，Rappas M，Doré A S，et al.Structure of the complement C5a receptor bound to the extra-helical antagonist NDT9513727[J].Nature，2018，553（7686）：111-114.

[11] Hwang D E，Choi J M，Yang C S，et al.Effective suppression of C5a-induced proinflammatory response using anti-human C5a repebody[J].Biochem Biophys Res Commun，2016，477（4）：1072-1077.

[12] Fattahi F，Kalbitz M，Malan E A，et al.Complement-induced activation of MAPKs and Akt during sepsis：role in cardiac dysfunction[J].FASEB J，2017，31（9）：4129-4139.

[13]魏永軍，王瑞蘭，李國平.眼鏡蛇毒因子抑制補體激活對創(chuàng)傷失血性休克大鼠血漿內(nèi)毒素含量的影響[J].中國危重病急救醫(yī)學(xué)，2006，18（3）：180-183.

[14]翟紅霞，姚詠明，陸連榮，等.燙傷大鼠組織腫瘤壞死因子mRNA表達與內(nèi)毒素血癥的關(guān)系[J].中華整形燒傷外科雜志，1999，15（6）：424-427.

[15]隰建成，馬遠征，周寶桐，等.創(chuàng)傷性膿毒癥外周血中性粒細胞及組織中腫瘤壞死因子-αmRNA表達的變化[J].中國危重病急救醫(yī)學(xué)，2006，18（1）：28-31.

[16] Eks L，Gillrie M R，Li L，et al.Leukotriene B4-Mediated Neutrophil Recruitment Causes Pulmonary Capillaritis during Lethal Fungal Sepsis[J].Cell Host Microbe，2018，23（1）：121-133.

[17] Denk S，Taylor R P，Wiegner R，et al.Complement C5a-induced changes in neutrophil morphology during inflammation[J].Scand J Immunol，2017，86（3）：143-155.

[18] Bosmann M，Ward P A.The inflammatory response in sepsis[J].Trends Immunol，2013，34（3）：129-136.

[19] Hattori Y，Hattori K，Suzuki T，et al.Recent advances in the pathophysiology and molecular basis of sepsis-associated organ dysfunction：Novel therapeutic implications and challenges[J].Pharmacol Ther，2017，177（2）：56-66.

[20] Rosenthal M D，Moore F A.Persistent Inflammation，Immunosuppression，and Catabolism：Evolution of Multiple OrganDysfunction[J].Surg Infect（Larchmt），2016，17（2）：167-172.

[21] van der Poll T.Immunotherapy of sepsis[J].Lancet Infect Dis，2001，1（3）：165-174.

[22] Hotchkiss R S，Monneret G，Payen D.Immunosuppression in sepsis：a novel understanding of the disorder and a new therapeutic approach[J].Lancet Infect Dis，2013，13（3）：260-268.

[23] Boomer J S，Green J M，Hotchkiss R S.The changing immune system in sepsis：is individualized immuno-modulatory therapy the answer？[J].Virulence，2014，5（1）：45-56.

[24] Patil N K，Bohannon J K，Sherwood E R.Immunotherapy：a promising approach to reverse sepsis-induced immunosuppression[J].Pharmacol Res，2016，111（2）：688-702.

（收稿日期：2018-02-07） （本文編輯：董悅）