邢建宇，申 宇，馮冬冬

(1.長安大學環(huán)境科學與工程學院，陜西西安710054；2.長安大學旱區(qū)地下水文與生態(tài)效應教育部重點實驗室，陜西西安710054)

明膠是膠原蛋白水解后的產(chǎn)物，因其具有原料易得、制備工藝簡單、生物可降解性強及生物兼容性好等特點，使得明膠廣泛應用于食品、醫(yī)藥和組織工程材料等多個領(lǐng)域[1-3]。但是以往的研究及應用主要集中于利用明膠生物降解性強、生物兼容性好的特點，而對于明膠在使用過程中的結(jié)構(gòu)變化以及由此對于合成材料整體上理化性質(zhì)的影響關(guān)注較少。

明膠的變性溫度約為35 ℃，其無規(guī)則卷曲轉(zhuǎn)變?yōu)槁菪Y(jié)構(gòu)的過程可分為兩個階段，當冷卻開始時，螺旋結(jié)構(gòu)的形成速率較快，持續(xù)幾分鐘，然后進入一個較長的慢速率時期，最終達到膠原狀態(tài)的平衡。與其他具有螺旋結(jié)構(gòu)的生物多聚體(如，多糖、DNA等)相比，明膠的復性速率相對較慢，這主要是由于大量存在的肽鍵需要高的活化能(約72 kJ/mol)進行順反異構(gòu)反應以形成三螺旋結(jié)構(gòu)[4]。當高于變性溫度的明膠無規(guī)則卷曲被冷卻時，部分的明膠鏈可以復性到螺旋狀態(tài)及三螺旋狀態(tài)，但是復性的程度取決于很多因素，如濃度、溫度、壓力、溶劑以及有無化學交聯(lián)劑[5-8]。Gandhi等[9]研究發(fā)現(xiàn)，在攪拌的條件下，高于變性溫度存在的明膠無規(guī)則卷曲，可部分復性為螺旋結(jié)構(gòu)，因此在體積上呈現(xiàn)大的差異，并將該種復性歸結(jié)于攪拌條件下明膠鏈的伸展與定向排列。除了復性帶來的體積上的變化外，明膠復性還會帶來其力學性能方面的提高，影響其在生物材料中的應用[10]。

α-螺旋多肽的生物學功能主要是由分子軸上大的宏觀偶極矩(每個氨基酸殘基的偶極矩大約為11.669×10-30C·m)引起的，而且偶極產(chǎn)生靜電場，并在氨基端產(chǎn)生正電荷、在羧基端產(chǎn)生負電荷。α-螺旋多肽大偶極距在生物體系中蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能方面起著非常重要的作用。目前在很多非等軸材料研究中，已經(jīng)將注意力集中在有助于分子排列調(diào)節(jié)的靜電作用上[14]。研究結(jié)果表明，外加靜電場的存在，確實有助于α-螺旋多肽分子的排列，對于電場中的多肽分子具有一定的導向作用[15-17]。但是，目前的研究主要集中在采用接觸式電場作用的影響，即通過電極表面多肽片段的排列來考察電場的影響，鑒于非接觸式靜電場在果蔬保藏方面的應用[18]，可以預見，在明膠溶液兩端施加非接觸式靜電場，將有助于明膠多肽分子微觀結(jié)構(gòu)的伸展，對明膠的卷曲-螺旋結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化起到積極的輔助作用。

本文中，筆者擬在非接觸式靜電場的作用下研究明膠的螺旋-卷曲轉(zhuǎn)化，通過電場強度與濃度、溫度和溶劑的協(xié)同作用，考察電場作用對于明膠卷曲-螺旋變化的輔助作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

明膠(化學純)，國藥集團化學試劑有限公司；乙二醇(分析純)，天津市化學試劑六廠；WXG-4 型旋光儀，西安精科有限公司；DYY-6B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電源，北京六一儀器廠。實驗中所用的水均為美國Millipore公司生產(chǎn)純水儀所制的標準為18.2 Ω去離子水。

1.2 實驗方法

圖1為靜電場的構(gòu)建示意圖。通過將8 cm×8 cm兩塊銅片平行放置，間距6 cm，并在銅片上施加電壓來實現(xiàn)。使用水及乙二醇溶液配制不同濃度明膠溶液，置于靜電場環(huán)境中，分別施加100、250和500 V電壓(對應電場強度分別為1 667、4 167和8 333 V/m)，測試并考察溶液旋光度的變化，明膠的結(jié)構(gòu)改變會引起整體明膠溶液旋光度的改變，采用比旋光度法可測定明膠溶液中分子結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變[19]，每組實驗均做3個平行，最終數(shù)據(jù)取平均值。

比旋光度的計算公式為：[α]=α/Lρ。 其中，α為測得的旋光度(°)，L為溶液長度(dm)，ρ為溶液的質(zhì)量濃度(g/mL)。

圖1 非接觸式靜電場的構(gòu)建示意Fig.1 Diagram of non-contact electrostatic field construction

2 結(jié)果與討論

2.1 電場對明膠溶液卷曲-螺旋轉(zhuǎn)化的輔助作用

明膠溶液中螺旋組分的含量與溶液中旋光度成正比關(guān)系，且由于明膠為左旋化合物，故旋光度為負值。考察電場對明膠溶液卷曲-螺旋轉(zhuǎn)化的輔助作用，結(jié)果見圖2。由圖2可知，靜電場對室溫及冰浴條件下的明膠溶液均有不同程度的輔助作用。在室溫條件下，4 mg/mL明膠溶液的旋光度隨著時間的延長而增大，并在10 min以后趨于平衡。而平衡時的旋光度與電場強度關(guān)系密切，其數(shù)值隨著電場強度的升高而升高。冰浴條件下，由于溫度的降低，明膠溶液的旋光度數(shù)值變化很大，增幅約為17.25倍，遠高于常溫下8 333 V/m的靜電場對明膠的復性輔助作用。在冰浴的基礎上，電場的輔助作用更為明顯。冰浴條件下(圖2(b))，當電場強度1 667 V/m時，旋光度的數(shù)值有約30%的升高，而后隨著電場強度的升高，旋光度值趨于穩(wěn)定；當電場強度為4 167 V/m和8 333 V/m時，電場強度對明膠卷曲-螺旋轉(zhuǎn)化的輔助作用達到極限。

圖2 靜電場對明膠溶液旋光性的影響Fig.2 Effects of electrostatic field on optical rotation of gelatin solution

2.2 靜電場對不同濃度明膠結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化的影響

考察電場強度對不同質(zhì)量濃度(1、2、4和8 mg/mL)明膠結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化的影響，結(jié)果見圖3。從圖3可以看出：明膠溶液質(zhì)量濃度為1 mg/mL時，溶液比旋光度受電場影響最大，說明此時單分子明膠的伸展由于受到電場的引導，從無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)達到伸展狀態(tài)，而隨著濃度的增加，明膠分子間作用力增強，電場的輔助作用依次減小，當質(zhì)量濃度達到8 mg/mL時，比旋光度略有上升，此時可能由于濃度較大，明膠溶液中分子數(shù)量巨大，而并非由于電場的輔助作用引起的明膠結(jié)構(gòu)改變導致的。

圖3 電場強度對不同濃度明膠結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化的影響Fig.3 Effects of electric field intensity on gelatin with different concentration

圖4 冰浴條件下靜電場對不同明膠濃度 明膠旋光性的影響Fig.4 Effects of electrostatic field on optical rotation of gelatin with different concentration in ice-bath

明膠溶液的旋光度變化與濃度、電場強度及溫度均相關(guān)。在冰浴條件下，考察電場強度對不同質(zhì)量濃度(1、2、4和8 mg/mL)的明膠結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化的影響，結(jié)果見圖4。由圖4可知：電場引起的旋光度增量隨著濃度的升高也降低了約4.7倍。此結(jié)果表明，高濃度明膠溶液不利于明膠分子的伸展，所以無規(guī)則卷曲狀態(tài)向α-螺旋狀態(tài)的轉(zhuǎn)化受到抑制。已有的研究結(jié)果表明[17]，濃度不同的明膠溶液遵循不同的復性速率，稀溶液中，符合一級動力學模型，此時的復性機制可能主要為單鏈分子內(nèi)的折疊復性，復性的速率與濃度無關(guān)。高濃度時，明膠分子的復性則復雜得多，不僅涉及分子內(nèi)的折疊復性，還涉及分子間的相互作用，此時復性的過程是與濃度相關(guān)的。在冰浴條件下，靜電場的輔助作用對于低質(zhì)量濃度明膠溶液(0.5 mg/mL)更加明顯，在冰浴條件下，8 333 V/m的電場強度對于0.5 mg/mL的復性增幅約為8 mg/mL條件下的5倍。

2.3 乙二醇溶液中電場強度對低濃度明膠的影響

乙二醇的添加，不僅會增大溶液體系的黏度，還可通過氫鍵作用維持明膠的構(gòu)象?？疾煲叶既芤褐须妶鰪姸葘Φ蜐舛?1 mg/mL)明膠的影響，結(jié)果見圖5。由圖5可知：常溫下，當明膠質(zhì)量濃度為1 mg/mL時，乙二醇體積分數(shù)的改變幾乎對明膠的復性行為沒有影響。但是當處于冰浴狀態(tài)下時，電場的輔助行為明顯升高，且電場的電場強度越大，變化的幅度越大。而乙二醇體積分數(shù)的升高，有利于通過肽-肽氫鍵作用維持已復性的螺旋結(jié)構(gòu)[19]，故溶液旋光度的變化也依次升高。

圖5 乙二醇溶液中電場強度對低濃度明膠的影響Fig.5 Effects of electrostatic field on optical rotation of gelatin with low concentration in glycol solution

2.4 乙二醇溶液中電場強度對高濃度明膠的影響

考察乙二醇溶液中電場強度對高濃度(4 mg/mL)明膠的影響，結(jié)果見圖6。由圖6可知：當明膠質(zhì)量濃度較高時，此時，明膠分子間較為擁擠，明膠的復性不僅涉及到分子內(nèi)作用力，還涉及到分子間作用力，高濃度的明膠溶液不利于明膠分子的伸展，所以電場的導向牽引作用不易引起明膠分子的復性，電場輔助作用在常溫及冰浴條件下帶來的變化都不大。此時，乙二醇的體積分數(shù)變化對于明膠的復性維持作用同樣影響不大，并且明膠的復性作用與乙二醇的濃度并不呈線性關(guān)系，當乙二醇體積分數(shù)為50%時，電場引起的復性作用略高一些。

圖6 乙二醇溶液中電場強度對高濃度明膠的影響Fig.6 Effects of electrostatic field on optical rotation of gelatin with high concentration in glycol solution

3 結(jié)論

考察了靜電場對明膠結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化的影響，發(fā)現(xiàn)靜電場對明膠的卷曲-螺旋轉(zhuǎn)化隨著電場強度的升高而逐漸增強，隨著明膠濃度的增加而降低，且降低的程度與明膠分子間作用力關(guān)系密切。通過對溶劑的研究發(fā)現(xiàn)，電場作用對明膠的復性作用與溶劑有很大關(guān)系，低明膠濃度時，尤其是冰浴條件下，升高乙二醇體積分數(shù)有助于明膠的復性，而高濃度時，電場引起的輔助作用并不明顯，溶劑的影響也不明顯。