孟憲菁，楊 斌，馬 瀟，張宏博，徐 波，王 旭，尹 松

(1.賽默飛世爾科技(中國)有限公司，上海 201206；2.中國科學(xué)院西雙版納熱帶植物園，云南 勐侖 666303； 3.內(nèi)蒙古自治區(qū)食品檢驗(yàn)檢測中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010090；4.中海油能源發(fā)展股份有限公司，上海 200941； 5.中國科學(xué)院地質(zhì)與地球物理研究所，北京 100029)

近年來，連續(xù)流技術(shù)的元素分析-穩(wěn)定同位素比率質(zhì)譜儀(EA-IRMS)在線聯(lián)機(jī)系統(tǒng)已經(jīng)在食品[1-3]、農(nóng)業(yè)[4-5]、地質(zhì)[6-9]和環(huán)境[10-11]等領(lǐng)域取得了廣泛的應(yīng)用。基于快速燃燒的原理，EA-IRMS將固態(tài)或粘稠態(tài)樣品中總氮、總碳和總硫轉(zhuǎn)化為氣態(tài)的N2、CO2和SO2，實(shí)現(xiàn)了δ15N、δ13C和δ34S的高精度準(zhǔn)確測量[12-18]。以往大多數(shù)EA-IRMS是通過70 ℃恒溫氣相色譜柱(GC)分離N2、CO2和SO2樣品，至少需20 min才能完成1次δ15N、δ13C和δ34S分析[17]。較長的分析時(shí)間不但增加了測試成本，而且增加了測定結(jié)果的不確定性[6,12]。

目前新推出的EA IsoLink元素分析單元在功能設(shè)計(jì)上新增了程序升溫GC和氦氣節(jié)約模塊[18-19]。程序升溫GC能夠按設(shè)定的程序在2 min內(nèi)升至指定溫度(如240 ℃)，從而對樣品氣進(jìn)行快速脫附。這不僅可以得到更高靈敏度的峰高信號和尖銳的色譜峰形，還可縮短δ15N、δ13C和δ34S的分析時(shí)間(約10 min)[18]。氦氣節(jié)約模塊利用從反應(yīng)管流出的一部分載氣返回并吹掃進(jìn)樣口實(shí)現(xiàn)節(jié)約氦氣。另外，分析時(shí)間的縮短也間接地降低了載氣(氦氣)的使用量。程序升溫GC結(jié)合氦氣節(jié)約模塊可以將EA-IRMS聯(lián)機(jī)系統(tǒng)的氦氣節(jié)省60%以上[19]。由于氦氣資源的緊缺和價(jià)格的上漲，該聯(lián)機(jī)系統(tǒng)在經(jīng)濟(jì)上具有很大優(yōu)勢。

記憶效應(yīng)主要是指前一個(gè)樣品在該聯(lián)機(jī)系統(tǒng)管路中的殘留樣品會(huì)成為下一個(gè)樣品測定的“背景值”[20]，是影響EA-IRMS聯(lián)機(jī)系統(tǒng)對實(shí)際樣品測定精度和準(zhǔn)確度的重要因素[6,21]。研究表明[5,9-10,14]，EA-IRMS對δ15N和δ13C的分析通常不存在顯著的記憶效應(yīng)。由于恒溫GC條件下，SO2脫附較慢且不完全，柱殘留及色譜峰拖尾會(huì)導(dǎo)致34S具有一定的記憶效應(yīng)[6,12]。基于程序升溫GC的EA-IRMS在每次樣品分析時(shí)均對色譜柱進(jìn)行烘烤，以保持較低的柱殘留[18]。然而，有關(guān)其對34S記憶效應(yīng)影響的研究目前尚未見報(bào)道。

鑒于程序升溫GC的EA-IRMS在測定總氮、總碳和總硫穩(wěn)定同位素比率上具有一定的優(yōu)勢和應(yīng)用前景[18]，本研究擬綜合分析該聯(lián)機(jī)系統(tǒng)的穩(wěn)定性和樣品測量的準(zhǔn)確性。如，評價(jià)具有程序升溫GC的EA-IRMS性能及長期穩(wěn)定性；探討該聯(lián)機(jī)系統(tǒng)測定δ34S時(shí)硫的記憶效應(yīng)；揭示不同種類樣品的δ15N、δ13C和δ34S特征。希望為EA-IRMS技術(shù)的應(yīng)用與發(fā)展提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與參數(shù)

1.1.1主要儀器 EA-IRMS聯(lián)機(jī)系統(tǒng)主要由EA IsoLink元素分析單元、ConFlo Ⅳ連續(xù)流接口裝置和DELTA V Advantage穩(wěn)定同位素比率質(zhì)譜儀3部分組成，均為美國Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品。

EA IsoLink配有自動(dòng)進(jìn)樣器，并安裝了雙反應(yīng)器：一個(gè)是用于氮(N)、碳(C)、硫(S)同位素比率分析的快速燃燒反應(yīng)器；另一個(gè)是用于氫(H)和氧(O)同位素比率分析的高溫轉(zhuǎn)化反應(yīng)器?？焖偃紵磻?yīng)器可安裝18 mm外徑的反應(yīng)管進(jìn)行常規(guī)進(jìn)樣量(小于5 mg)樣品的分析；也可安裝25 mm外徑的反應(yīng)管用于常規(guī)進(jìn)樣量甚至大于50 mg樣品量(如，元素含量極低樣品)的分析[22]。燃燒反應(yīng)器采用氧化(三氧化鎢，WO3)和還原(銅，Cu)一體式設(shè)計(jì)，將被測樣品在高溫和過氧環(huán)境下瞬間燃燒，然后在Cu還原作用下形成N2、CO2和SO2氣體，這些氣體經(jīng)程序升溫GC快速分離后進(jìn)入ConFlo Ⅳ。

ConFlo Ⅳ是具有自動(dòng)稀釋功能的連續(xù)流通用接口，采用高純N2(99.999%)、CO2(99.995%)和SO2(99.990%)作為參比氣，并由高純氦氣(99.999%)稀釋和運(yùn)載，通過內(nèi)置的開口分流器將參比氣和樣品氣引入DELTA V Advantage同位素比率質(zhì)譜儀中。

DELTA V Advantage是具有3 kV加速電壓的氣體穩(wěn)定同位素比率質(zhì)譜儀。在1.6×10-7kPa超高真空條件下，采用通用三杯接收器同時(shí)采集N2氣體電離后產(chǎn)生的[14N2]+、[14N15N]+和[15N2]+分子離子束，或CO2氣體電離后產(chǎn)生的[12C16O2]+、[13C16O2]+和[12C16O18O]+分子離子束，或SO2氣體電離后產(chǎn)生的[32S16O2]+和[34S16O2]+分子離子束，再由不同電阻值的放大器轉(zhuǎn)化為電壓信號，完成δ15N、δ13C和δ34S的檢測。

1.1.2儀器參數(shù) EA IsoLink載氣流速和進(jìn)樣口吹掃流速分別設(shè)定為180、70 mL/min，結(jié)合氦氣節(jié)約模塊，從反應(yīng)管分流的載氣以130 mL/min返回并吹掃進(jìn)樣口，約2 min后終止該部分氣流的吹掃[19]。氧氣流速設(shè)為175 mL/min，噴氧時(shí)間設(shè)為3 s，對于一次進(jìn)樣超過1 mg C的樣品，噴氧時(shí)間設(shè)為6 s。燃燒爐溫度設(shè)為1 020 ℃，由于錫囊燃燒放熱，閃燃溫度實(shí)際上遠(yuǎn)大于1 020 ℃，可確保樣品充分反應(yīng)[22]。使用程序升溫GC，在δ15N和δ13C測定時(shí)GC溫度保持在55 ℃，而后2 min內(nèi)升溫至240 ℃進(jìn)行δ34S測定。

進(jìn)入ConFlo Ⅳ的N2、CO2和SO2樣品氣被氦氣稀釋的比例分別設(shè)定為0、79%和0。另外，對于一次進(jìn)樣超過1 mg C的樣品，CO2樣品氣被氦氣稀釋的比例設(shè)為96%。同時(shí)測定δ15N、δ13C和δ34S時(shí)，在樣品N2或SO2出峰之前引入N2或SO2參比氣，在樣品CO2出峰之后引入CO2參比氣。識(shí)別N2、CO2和SO2的起/止色譜峰斜率分別設(shè)為0.2/1、0.2/0.4和0.2/1 mV/s。背景值扣除方法采用Calc Mean BGD，即取出峰之前5 s的背景值(BGD)信號的平均值[20]。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1EA-IRMS聯(lián)機(jī)系統(tǒng)性能測試 為了檢驗(yàn)EA-IRMS聯(lián)機(jī)系統(tǒng)的氣密性，分別對該聯(lián)機(jī)系統(tǒng)m/z28、44、64的背景值(BGD)和空白(空錫囊)信號進(jìn)行10次測定。如無特別說明，本研究EA-IRMS性能測試和樣品分析均采用18 mm外徑的反應(yīng)管。

為了評價(jià)參比氣的穩(wěn)定性，分別進(jìn)行了N2、CO2和SO2參比氣的“零”富集測試和線性測試?！傲恪备患瘻y試中，連續(xù)引入10次相等峰高信號的參比氣脈沖，m/z28、44、64的峰高信號均為3 V。線性測試中，連續(xù)引入5～6次不同峰高信號的參比氣脈沖，m/z28、44、64的信號遞增區(qū)間均設(shè)為1～9 V。本研究在SO2鋼瓶上安裝了一個(gè)40 ℃恒溫減壓閥，并將ConFlo Ⅳ內(nèi)置的SO2參比氣減壓閥以及IRMS的進(jìn)氣針閥和離子源切換至加熱狀態(tài)，通過降低SO2氣體的粘滯性優(yōu)化色譜峰形。

在2017年5月至9月這4個(gè)月的時(shí)間內(nèi)，連續(xù)建立了δ15N、δ13C和δ34S的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以檢驗(yàn)聯(lián)機(jī)系統(tǒng)的長期穩(wěn)定性。構(gòu)建曲線的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)信息列于表1。使用USGS40、USGS41和USGS42共3個(gè)δ15N和δ13C標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，以(59±12) μg N和(221±32) μg C常規(guī)進(jìn)樣量，于5月4日、7月27日、8月9日、8月30日和9月4日分別建立了5條δ15N標(biāo)準(zhǔn)曲線和5條δ13C標(biāo)準(zhǔn)曲線。使用IAEA-S-1、IAEA-S-2和IAEA-SO-6共3個(gè)δ34S標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，以(70±32) μg S常規(guī)進(jìn)樣量，于5月4日、5月12日和5月19日建立了3條δ34S標(biāo)準(zhǔn)曲線。此外，還建立了小樣品量(9±2) μg N、(33±5) μg C和(8±2) μg S標(biāo)準(zhǔn)曲線，用以比較其與常規(guī)樣品量標(biāo)準(zhǔn)曲線之間的差異性。

表1 測試標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的同位素信息Table 1 Isotopic information of the standards

注：結(jié)果采用平均值±1SD/‰表示

1.2.234S記憶效應(yīng)分析 為了探討程序升溫GC的EA-IRMS聯(lián)機(jī)系統(tǒng)在測定δ34S時(shí)硫記憶效應(yīng)的影響，分別使用18、25 mm反應(yīng)管測定δ34S相差較大的USGS42、IAEA-SO-6、IAEA-S-1、IAEA-S-2和EMA-P1系列標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。每種標(biāo)物以(50±10) μg S常規(guī)進(jìn)樣量，至少重復(fù)4次。由于25 mm反應(yīng)管的SO2樣品峰存在一定的延遲和拖尾問題[22]，可能導(dǎo)致其分析δ34S時(shí)存在記憶效應(yīng)，本研究通過采用在不同標(biāo)物間添加空錫囊測定的方法，檢驗(yàn)34S記憶效應(yīng)消除的程度。

1.2.3不同類型樣品同位素比率的測定 將烘干的羊肉(包括腹下肌、肱三頭肌、背最長肌和肱二頭肌)、海參(野生和人工)、金銀花、干酪根、木材和琥珀6種樣品研磨成粉末，根據(jù)N、C、S元素含量分別稱取0.6 mg羊肉、海參和金銀花，1 mg干酪根，1.5 mg木材， 3 mg琥珀，待測樣品用錫囊緊密包裹，每種樣品至少重復(fù)測定3次。木材樣品以及構(gòu)建δ34S標(biāo)準(zhǔn)曲線的IAEA-SO-6屬不易完全燃燒的物質(zhì)，應(yīng)與2 mg五氧化二釩(V2O5)一起混入錫囊，由于V2O5的催化作用，即使溫度低于1 000 ℃也能充分燃燒[12,23]。實(shí)驗(yàn)于2017年5月4日采用程序升溫GC的EA-IRMS及其內(nèi)置熱導(dǎo)檢測器(TCD)，通過一次進(jìn)樣快速完成樣品中N、C、S同位素組成及元素含量的測定。樣品δ15N和δ13C的測定結(jié)果由USGS40、USGS41和USGS42構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行校正，δ34S由IAEA-S-1、IAEA-S-2和IAEA-SO-6構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行校正，校正方法參照文獻(xiàn)[24]。

2 結(jié)果與討論

2.1 EA-IRMS聯(lián)機(jī)系統(tǒng)穩(wěn)定性

多次測定表明，EA-IRMS聯(lián)機(jī)系統(tǒng)m/z28、44、64的背景值(BGD)分別小于45、1、20 mV。BGD低信號表明，該聯(lián)機(jī)系統(tǒng)氣密性和運(yùn)行狀態(tài)良好，受外界環(huán)境干擾小[6,10,15-16]。空白(空錫囊)燃燒產(chǎn)生的[14N2]+、[12C16O2]+和[32S16O2]+信號分別小于10、20、15 mV。本研究絕大多數(shù)樣品信號大于1 V，達(dá)到空白信號的50倍以上，因此，可忽略空白對同位素比率測定結(jié)果的影響[6]。如果被測樣品信號小于1 V，信噪比降低，空白效應(yīng)則不可忽略，一般采取差減法[15]進(jìn)行空白校正。

參比氣的“零”富集測試表明，δ15N、δ13C和δ34S的測定精度分別為0.018‰、0.033‰和0.038‰，均優(yōu)于EA-IRMS聯(lián)機(jī)系統(tǒng)出廠技術(shù)指標(biāo)0.06‰的要求[20]。線性測試表明，δ15N、δ13C和δ34S與相應(yīng)的m/z28、44、64峰高信號之間的線性斜率分別為0.001 3‰/V、0.009 6‰/V和0.059 5‰/V，優(yōu)于該系統(tǒng)出廠技術(shù)指標(biāo)±0.066‰/V的要求[20]。

不同時(shí)間建立的δ15N、δ13C和δ34S標(biāo)準(zhǔn)曲線均具有較好的重現(xiàn)性，示于圖1。δ15N和δ13C標(biāo)準(zhǔn)曲線(L1～L5)斜率為0.99～1.01，截距分別為(-1.43±0.07)‰和(-32.38±0.12)‰；δ34S標(biāo)準(zhǔn)曲線(L1～L3)斜率為1.05～1.07，截距為(-2.54±0.13)‰。截距表示參比氣的同位素比率[24]均具有良好的重現(xiàn)性。由于SO2目標(biāo)氣中相等質(zhì)量數(shù)的32S18O16O對34S16O2存在干擾，即氧同位素影響硫同位素的測定結(jié)果[13]，這可能是δ34S標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率偏離的重要原因。基于協(xié)方差(ANCOVA)和最小顯著性差異法(LSD)分析表明，不同時(shí)期δ15N、δ13C和δ34S的標(biāo)準(zhǔn)曲線不存在顯著差異(p>0.05)，即無明顯的時(shí)間漂移。將USGS42的測定結(jié)果(n=41)代入上述任意一條標(biāo)準(zhǔn)曲線中，得到校正后的δ15N和δ13C精度和準(zhǔn)確度均優(yōu)于0.3‰，δ34S精度和準(zhǔn)確度均優(yōu)于0.6‰，能夠滿足EA-IRMS測試要求[20，22]。這表明，該聯(lián)機(jī)系統(tǒng)每隔1個(gè)月只需建立1次標(biāo)準(zhǔn)曲線，以提高樣品分析效率。此外，小樣品量標(biāo)準(zhǔn)曲線(δ15N和δ13C，L6；δ34S，L4)與常規(guī)樣品量標(biāo)準(zhǔn)曲線之間存在顯著差異(p<0.01)。因此，小樣品量樣品需要另外建立自身的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行校正。

不同時(shí)間測定的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)δ15N、δ13C和δ34S具有良好的重現(xiàn)性，示于圖2。本研究中，δ15N、δ13C和δ34S的測定結(jié)果均采用不同時(shí)間建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行實(shí)時(shí)校正。5個(gè)月內(nèi)重復(fù)測定標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)USGS42的δ15N、δ13C和δ34S，其平均測定值分別為(8.01±0.11)‰、(-21.11±0.13)‰和(7.77±0.23)‰(n=41)，分析誤差均小于0.1‰。1個(gè)月內(nèi)重復(fù)測定IAEA-S-1、IAEA-S-2和IAEA-SO-6三種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的δ34S，其平均測定值分別為(-0.36±0.21)‰(n=14)、(22.56±0.28)‰(n=23)和(-34.14±0.28)‰(n=26)，分析誤差均小于0.1‰。這些測量結(jié)果能夠滿足氮、碳和硫元素穩(wěn)定同位素分析精度和準(zhǔn)確度的要求[20，22]。

注：*代表小樣品量測定結(jié)果建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線 圖1 不同測量時(shí)間δ15N(a)、δ13C(b)和δ34S(c)的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Correction curves of δ15N (a), δ13C (b) and δ34S (c) at different measurement times

注：a.USGS42；b.無機(jī)硫標(biāo)物 圖2 不同測量時(shí)間標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)δ15N、δ13C和δ34S的重現(xiàn)性Fig.2 Reproduction of δ15N, δ13C and δ34S of the standards at different measurement times

2.2 燃燒SO2分析法中34S的記憶效應(yīng)

注：↓代表不同標(biāo)物間添加1個(gè)空錫囊 圖3 18 mm(a)和25 mm(b, c) 反應(yīng)管分析δ34S時(shí)的記憶效應(yīng)Fig.3 Memory effects for δ34S measured through the 18 mm (a) and 25 mm (b, c) reactor tubes

由于EA-IRMS聯(lián)機(jī)系統(tǒng)對N2和CO2無顯著柱殘留及峰拖尾[5,9-10,14]，本研究重點(diǎn)探討了34S的記憶效應(yīng)，示于圖3。結(jié)合程序升溫GC，每次樣品分析時(shí)均對色譜柱進(jìn)行烘烤(240 ℃，4 min)，可以保證較低的柱殘留[18]。采用18 mm反應(yīng)管測定δ34S時(shí)無顯著記憶效應(yīng)(p>0.05)，不同標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)δ34S的測定精度為0.04‰～0.18‰，示于圖3a。雖然18 mm反應(yīng)管與25 mm反應(yīng)管測定同一樣品δ15N、δ13C和δ34S具有較好的重現(xiàn)性(SD<0.15‰，n=6)和一致性(Δ<0.3‰)[22]，但是，采用25 mm反應(yīng)管測定δ34S時(shí)存在一定的記憶效應(yīng)，δ34S測定精度為0.11‰～0.41‰，示于圖3b。這是由于相同條件下，25 mm反應(yīng)管的SO2樣品峰比18 mm反應(yīng)管略有延遲且拖尾[22]。當(dāng)采用25 mm反應(yīng)管測試時(shí)，在不同標(biāo)物間添加1個(gè)空錫囊后，記憶效應(yīng)影響顯著減弱，δ34S測定精度達(dá)到了0.08‰～0.22‰，示于圖3c。

2.3 不同類型樣品δ15N、δ13C和δ34S的測試結(jié)果

以往的EA-IRMS采用恒溫GC分離法，主要用于δ15N和δ13C的分析[4-5,14-16]。但是對于δ15N、δ13C和δ34S同時(shí)分析，GC70 ℃恒溫條件會(huì)導(dǎo)致SO2出峰較晚和拖尾，存在樣品分析時(shí)間較長以及分析效率較低等問題[6,12,17]。本研究采用程序升溫GC的EA-IRMS聯(lián)機(jī)系統(tǒng)對羊肉、海參、金銀花、干酪根、木材和琥珀樣品中N、C、S元素含量及其同位素組成進(jìn)行快速測定，結(jié)果列于表2。其中，C/N和C/S質(zhì)量比均小于200的樣品，δ15N、δ13C和δ34S測定精度分別為0.1‰、0.05‰和0.12‰。C/N或C/S質(zhì)量比大于2 000的木材及琥珀類樣品，其N2和SO2的信號強(qiáng)度小于0.5 V，此時(shí)，δ15N和δ34S測定精度分別優(yōu)于0.6‰和0.2‰。這表明，該系統(tǒng)測定不同C/N或C/S樣品時(shí)能夠達(dá)到研究所需的精度需求[20，22]。進(jìn)一步分析可知，雖然羊肉不同部位肌肉元素含量差異相差不大(p>0.05)，但其δ15N、δ13C和δ34S差異顯著(p<0.05)，這與文獻(xiàn)[1]的研究結(jié)果一致。野生海參與人工養(yǎng)殖海參的δ13C存在顯著差別(p<0.05)，表明二者可能具有不同的食物來源[3]。

表2 不同類型樣品N、C和S同位素組成Table 2 Isotopic composition of different samples

注：元素含量采用平均值(RSD/%)表示，同位素組成采用平均值±1SD/‰表示；每列不同小寫(羊肉：abcd)或大寫字母(海參：AB)代表差異在p<0.05水平上達(dá)到顯著

3 結(jié)論

本研究采用具有程序升溫GC的連續(xù)流EA-IRMS聯(lián)機(jī)系統(tǒng)，對δ15N、δ13C和δ34S進(jìn)行快速(約10 min)測定。結(jié)果表明，該聯(lián)機(jī)系統(tǒng)的運(yùn)行狀態(tài)良好，m/z28、44、64的背景值都小于50 mV，空白信號都小于20 mV，參比氣“零”富集測試和線性測試均優(yōu)于儀器出廠技術(shù)指標(biāo)0.06‰和±0.066‰/V的要求。δ15N、δ13C和δ34S標(biāo)準(zhǔn)曲線無顯著時(shí)間漂移，每隔1個(gè)月只需建立1次標(biāo)準(zhǔn)曲線。6個(gè)月內(nèi)重復(fù)測定δ15N、δ13C和δ34S具有良好的長期穩(wěn)定性，外精度和準(zhǔn)確度分別優(yōu)于0.3‰和0.1‰。18 mm反應(yīng)管不存在34S記憶效應(yīng)，25 mm反應(yīng)管在添加空錫囊后可將34S記憶效應(yīng)顯著減弱。針對C/N、C/S均小于200的樣品，δ15N、δ13C和δ34S的測定精度均優(yōu)于0.15‰；對于具有極高C/N或C/S的木材及琥珀類樣品，δ15N和δ34S測定精度分別優(yōu)于0.6‰和0.2‰。