張伽妹，郭曉宇，全慶華，姬瑞芳，孫倩倩，田婧鋆，譚 鵬，劉永剛

(北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100102)

柘樹廣泛分布于我國的華南、華東、西南以及河北以南地區(qū)，柘木為桑科柘屬植物柘樹Cudraniatricuspidata(Carr.)Bur.的干燥根及木材，是我國傳統(tǒng)的中藥材，用于治療肝炎、風(fēng)濕病、跌打損傷、黃疽、疥瘡、痛經(jīng)、體內(nèi)外出血和慢性胃炎等疾病，具有非常重要的藥用價(jià)值[1]。柘木糖漿作為消化系統(tǒng)癌癥治療的輔助藥物，具有較好的臨床療效[2]。柘木含有豐富的黃酮類化合物，研究表明[3-5]，這些化合物表現(xiàn)出顯著多樣的生物活性，如抗腫瘤、抗炎、抗菌、抗脂質(zhì)過氧化以及保肝等活性。此外, 柘木中還含有占噸酮類、生物堿、木質(zhì)素、香豆素等成分，但藥理作用尚未明確。

電噴霧離子源質(zhì)譜具有靈敏度高、操作簡便、分子離子峰豐度高等優(yōu)點(diǎn)[6-8]，線性離子阱與Orbitrap傅里葉掃描質(zhì)譜組成的串聯(lián)質(zhì)譜儀能夠?qū)㈦x子阱與質(zhì)譜的高分辨能力結(jié)合起來，實(shí)現(xiàn)母離子和多級質(zhì)譜碎裂的高分辨采集。目前，對柘木的研究主要集中在黃酮類成分的分離與活性評價(jià)[9-12]，尚未見采用液相色譜-質(zhì)譜(LC/MS)法分析柘木中化學(xué)成分的報(bào)道。

本研究擬采用高分辨質(zhì)譜法對柘木中多種組分進(jìn)行快速識別，以期為柘木的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)，為類似化合物的質(zhì)譜裂解途徑研究提供方法參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與設(shè)備

Accele 600 Pump高效液相色譜儀，LTQ-Orbitrap線性離子阱-串聯(lián)靜電軌道場高分辨質(zhì)譜儀：美國Thermo Fisher公司產(chǎn)品，配有電噴霧離子源和Xcalibar 2.0工作站；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；BT125D十萬分之一型電子天平：德國Satorious公司產(chǎn)品。

1.2 主要材料與試劑

柘木：采自山東沂水，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)劉勇教授鑒定為?？浦参镨蠘銫udraniatricuspidata(Carr.) Bur.的干燥莖。

甲醇：分析純，北京化工廠產(chǎn)品；乙腈、甲酸：質(zhì)譜純,美國Thermo Fisher公司產(chǎn)品；水：娃哈哈純凈水。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1色譜條件 色譜柱：Agilent SB C18柱(4.6 mm×150 mm×5 μm)；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL/min；檢測波長：290 nm；流動(dòng)相：A為水(含0.1%甲酸)，B為乙腈；梯度洗脫條件：0～15 min(10%B)，15～40 min(10%～15%B)，40～65 min(15～35%B)，65～90 min(35%～90%B)；進(jìn)樣量：10 μL。

1.3.2質(zhì)譜條件 FT Orbitrap質(zhì)量檢測器；電噴霧離子源(ESI)；質(zhì)量掃描范圍m/z100～1 000；噴霧電壓4.0 kV；管狀透鏡電壓110 V；毛細(xì)管溫度350 ℃；鞘氣流量30 L/h，輔助氣流量10 L/h；采用負(fù)離子掃描模式，分辨率設(shè)為30 000；二級和三級質(zhì)譜采用數(shù)據(jù)依賴性掃描，選取上一級豐度最高的3個(gè)峰進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離(CID)碎片掃描，以離子阱檢測碎片離子。

1.4 供試樣品的制備

精密稱取約1 g柘木藥材于錐形瓶中，加入25 mL甲醇，超聲處理1 h，用甲醇補(bǔ)足質(zhì)量損失，過濾后得到濾液，取上清液過0.45 μm微孔濾膜，即得供試品溶液。

2 結(jié)果與討論

在ESI負(fù)離子模式下，柘木供試品溶液的總離子流圖示于圖1?？梢钥闯?，多數(shù)化合物有較高的響應(yīng)，因此本實(shí)驗(yàn)選擇負(fù)離子模式檢測樣品。在質(zhì)譜分析中，通過高分辨質(zhì)譜計(jì)算各個(gè)主要成分的元素組成，參考相關(guān)文獻(xiàn)[14-17]，并結(jié)合二級質(zhì)譜的裂解碎片信息，對HPLC分離出的柘木的主要色譜峰進(jìn)行分析和鑒定，共推斷出45種化合物，結(jié)果列于表1。

圖1 負(fù)離子模式下，柘木樣品的總離子流圖Fig.1 TIC of Cudrania tricuspidata (Carr.) Bur at the negative ion mode

序號No.保留時(shí)間tR/min化合物名稱Compounds分子式Molecularformulas準(zhǔn)分子離子峰Molecularion peaks[M-H]-/(m/z)碎片離子信息Fragment ions/(m/z)12.65二氫槲皮素-7-葡萄糖苷C21H22O12465.1151303.0505,285.065224.38二氫山奈酚-7-葡萄糖苷C21H22O11449.1083287.055535.07山奈酚-3,7-二葡萄糖苷C27H30O16609.1440447.0920,285.0826419.58槲皮素-7-葡萄糖苷C21H20O12463.0876301.0345,107.8817525.19山奈酚-7-葡萄糖苷C21H20O11447.0926285.0396644.06槲皮素C15H10O7301.0342150.8902,162.9525 713.97花旗松素C15H12O7303.0501284.9781851.27柚皮素C15H12O5271.0603151.0034,106.8443954.29山奈酚C15H10O6285.0396257.1484,185.0302,150.88061022.06二氫山奈酚C15H12O6287.0555259.1347,272.0603,242.9993,124.86731151.80染料木素C15H10O5269.0448224.9569,201.1620,180.9991,241.1158,132.94581251.335, 7, 4'-三羥基二氫異黃酮C15H12O5271.0603243.1298

續(xù)表1

在已鑒定的45種化合物中，包括28種黃酮類(黃酮醇類、二氫黃酮、異黃酮類及黃酮苷類化合物)、11種占噸酮、6種其他類化合物。由于同類化合物在質(zhì)譜中具有相似的裂解規(guī)律，因此選取有代表性的化合物闡述其詳細(xì)的裂解規(guī)律。

2.1 黃酮醇類化合物

以化合物6為例，其分子離子峰為[M-H]-m/z301.034 2，推斷該化合物的分子式為C15H10O7。以m/z301.034 2為母離子進(jìn)行二級質(zhì)譜分析，得到的圖譜中出現(xiàn)了明顯的m/z150.890 2(C7H3O4)和m/z162.952 5(C8H3O4)碎片離子。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[18]，推測該化合物為槲皮素。m/z150.890 2和m/z162.952 5為C環(huán)發(fā)生1,3鍵和0,2鍵裂解產(chǎn)生的[A1,3]-和[A0,2]-碎片離子，其中[A1,3]-為黃酮醇類的特征碎片離子，其結(jié)構(gòu)和裂解途徑示于圖2。

圖2 槲皮素的裂解途徑Fig.2 Fragmentation pathway of quercetin

2.2 異黃酮類化合物

以化合物11為例，其分子離子峰為[M-H]-m/z269.044 8，推斷該化合物的分子式為C15H10O5。以m/z269.044 8為母離子進(jìn)行二級質(zhì)譜分析，圖譜中出現(xiàn)m/z201.162 0(C12H9O3) 和m/z132.945 8(C8H5O2)碎片離子，推測該化合物為染料木素。m/z201.162 0為A環(huán)失去C3O2碎片得到，相對豐度達(dá)61.25%，m/z132.945 8為C環(huán)發(fā)生0,3鍵裂解產(chǎn)生的[B0,3]-碎片離子，其結(jié)構(gòu)及裂解方式示于圖3。

圖3 染料木素的裂解途徑Fig.3 Fragmentation pathway of genistein

化合物18的分子離子峰為[M-H]-m/z299.055 3，推斷該化合物的分子式為C16H12O6，二級碎片離子為m/z283.989 7，推測其由[M-H]-丟失CH3所得。根據(jù)文獻(xiàn)推測[19]，該化合物為3′-O-甲基奧洛波爾。

2.3 黃酮類化合物

以化合物24為例，其分子離子峰為[M-H]-m/z337.107 3，推斷該化合物的分子式為C20H18O5。以m/z337.107 3為母離子進(jìn)行二級質(zhì)譜分析，圖譜中出現(xiàn)m/z281.107 6(C16H9O5)、293.092 3(C18H13O4)、321.963 8(C19H14O5) 和m/z219.071 4(C12H11O4)碎片離子，推測該化合物為8-異戊烯基-芹菜素。m/z281.107 6碎片離子為[M-H-56]-(A環(huán)失去異丁烯分子)，m/z321.963 8由[M-H-CH3]-產(chǎn)生，m/z293.092 3為m/z321.963 8進(jìn)一步丟失CHO產(chǎn)生，m/z219.071 4為C環(huán)發(fā)生1,3鍵裂解產(chǎn)生的[A1,3]-碎片離子。該化合物的二級裂解途徑主要為丟失異丁烯分子，其裂解方式示于圖4。

化合物13的分子離子峰為[M-H]-m/z351.086 2，推斷該化合物的分子式為C20H16O6。以m/z351.086 2為母離子進(jìn)行二級質(zhì)譜分析，得到碎片離子m/z333.090 2(C20H13O5)和m/z295.095 8(C16H7O6)，推測該化合物為環(huán)桂木黃素。m/z333.090 2為該分子離子峰失去1分子H2O所得，m/z295.095 8為[M-H]-失去異丁烯分子所得，相對豐度為16.17%，可見環(huán)桂木黃素的二級質(zhì)譜裂解方式主要為失去1分子H2O。

圖4 8-異戊烯基-芹菜素的裂解途徑Fig.4 Fragmentation pathway of 8-prenylapigenin

2.4 二氫黃酮醇類化合物

化合物19～22分別為Gericudranins A、Gericudranins B、Gericudranins D、Gericudranins E，分子離子峰分別為m/z515.133 7(C29H23O9)、409.164 7(C22H17O8)、499.138 9(C29H23O8) 和393.096 9(C22H17O7)。化合物19、20的二級質(zhì)譜碎片均為[M-H]-丟失1分子H2O所得，化合物21、22的二級質(zhì)譜碎片均為[M-H]-丟失1分子CO所得，且化合物19、21的二級裂解均可得到m/z337.035 5(C17H5O8)碎片離子。

2.5 黃酮苷類化合物

根據(jù)質(zhì)譜信息，共推測出5種黃酮苷類化合物，該類化合物的裂解方式主要是脫去糖基產(chǎn)生[M-H-162]-碎片離子，將脫糖后的碎片進(jìn)行二級裂解，可進(jìn)一步推測其苷元結(jié)構(gòu)。

化合物1的二級碎片離子為m/z303.050 5(C15H11O7)、m/z285.065 2(C15H9O6)，可推測出其苷元為二氫槲皮素；化合物2的二級碎片為m/z287.055 5(C15H11O6)，可推測其苷元為二氫山奈酚；化合物3失去1分子葡萄糖的二級碎片離子為m/z447.092 0，再失去1分子葡萄糖得到m/z285.062 6(C15H9O6)碎片，可推測其苷元為山奈酚；化合物4的二級碎片離子為m/z301.034 5(C15H9O7)、m/z107.881 7(C6H4O2)，可推測其苷元為槲皮素。根據(jù)相關(guān)裂解規(guī)律，推測化合物1～4分別為二氫槲皮素-7-葡萄糖苷、二氫山奈酚-7-葡萄糖苷、山奈酚-3，7-二葡萄糖、槲皮素-7-葡萄糖苷。

2.6 占噸酮類化合物

化合物31、33、34具有相同的分子離子峰 [M-H]-m/z395.149 0，分子式為C23H24O6，這3種化合物可能為同分異構(gòu)體。根據(jù)極性大小，推測它們分別為柘樹占噸酮J、柘樹占噸酮L、柘樹占噸酮M。柘樹占噸酮J和柘樹占噸酮M的二級質(zhì)譜裂解均可得到碎片離子m/z339.270 2[M-H-56]-。3種化合物的二級裂解均可得到m/z351.116 9[M-H-CO2]-碎片離子。柘樹占噸酮J、柘樹占噸酮M的m/z351.116 9碎片離子的相對豐度分別為40.19%、72.25%，而柘樹占噸酮L的m/z351碎片離子為其二級質(zhì)譜的最高峰，因此三者丟失CO2的難度順序?yàn)殍蠘湔紘嵧狶>柘樹占噸酮M>柘樹占噸酮J。這3種化合物的結(jié)構(gòu)式示于圖5。

化合物29、32的分子式均為C23H22O6，這兩個(gè)化合物可能為同分異構(gòu)體，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[20-21]推測，它們分別為柘樹占噸酮B、柘樹占噸酮K，其二級質(zhì)譜裂解均可得到m/z378.210 5[M-H-CH3]-碎片離子，進(jìn)一步丟失CH3、CH2可得到m/z349.172 0碎片離子。

圖5 柘樹占噸酮J(a), 柘樹占噸酮L(b), 柘樹占噸酮M(c)的結(jié)構(gòu)式Fig.5 Chemical structures of Cudraxanthone J (a), Cudraxanthone L (b) and Cudraxanthone M (c)

3 結(jié)論

本研究采用LTQ-Orbitrap質(zhì)譜分析柘木中化學(xué)成分，共鑒別了柘木中45種化合物，包括28種黃酮類、11種占噸酮類和6種其他類化合物，其中芹菜素和二氫槲皮素-7-葡萄糖苷為柘木中首次發(fā)現(xiàn)。本研究鑒定的化合物大多數(shù)源于對已知化合物的篩查，對未知化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)確認(rèn)仍較為困難，尤其是對結(jié)構(gòu)高度相似的同分異構(gòu)體，需要結(jié)合核磁共振等技術(shù)進(jìn)一步分析，以獲得化合物的準(zhǔn)確結(jié)構(gòu)。

通過實(shí)驗(yàn)總結(jié)了不同類型化合物的裂解規(guī)律，可為柘木的化學(xué)成分研究提供依據(jù)，也可為柘木質(zhì)量控制及藥效研究奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。