蘭阿峰， 郭素芬， 王 菲， 鄧百萬， 劉開輝

(1.陜西理工大學生物科學與工程學院，陜西漢中 723001； 2.陜西省食藥用菌工程技術(shù)研究中心，陜西漢中 723001

木蘭科木蘭屬植物古旱蓮(MagnoliadenudateDest var.purpurascensRehd et Wils)產(chǎn)于中國，是國家Ⅱ級重點保護野生植物[1]。木蘭科植物木蘭(MagnolialilifloraDest.)、玉蘭(MagnoliadenudataDesr.)、厚樸(MagnoliaofficinalisRehd. et Wils.)、木蓮(ManglietiafordianaOliv.)、鵝掌楸(Liriodendronchinense(Hemsl.) Sarg.)[2]中許多種類是我國的傳統(tǒng)藥材。紫玉蘭(Magnolialiliiflora)、玉蘭(Magnolialiliiflora)、望春玉蘭 (Magnoliabiondii)、武當木蘭(Magnoliasprengeri)在中藥中統(tǒng)稱辛夷，其干燥花蕾有通鼻消炎、治療婦科病及抑制真菌等作用[3]。厚樸、凹葉厚樸(Magnoliaofficinalissp.Biloba)、長喙厚樸(Magnoliarostrata)在中藥中統(tǒng)稱厚樸，是木蘭科植物厚樸或凹葉厚樸的干燥干皮、枝皮或根皮，是我國重要的傳統(tǒng)中藥。木蘭科植物的鵝掌楸屬、五味子屬和木蘭屬的厚樸、凹葉厚樸都屬于國家保護植物，已被列為瀕危藥用植物，其資源已經(jīng)非常有限。近年來，隨著老藥新用的提出，厚樸具有的抗病毒、抗腫瘤、抗菌、防齲、抗?jié)?、?zhèn)痛抗炎等作用及其他新的藥理藥效不斷被發(fā)現(xiàn)[4-5]。目前已經(jīng)從木蘭科中的鵝掌楸屬、五味子屬和木蘭屬的玉蘭、厚樸、凹葉厚樸中分離出大量內(nèi)生真菌，但并未發(fā)現(xiàn)其代謝產(chǎn)物對多種病原菌具有很強的抑制作用[6-10]。木蘭科植物內(nèi)生細菌多樣性及功能鮮見研究報道。

植物內(nèi)生細菌是指能夠從表面消毒后的植物組織內(nèi)分離到或者從植物內(nèi)提取到，并且對植物不造成可見危害的細菌[5]。陜西省漢中市勉縣武侯祠的資料顯示，1979年文物普查時，發(fā)現(xiàn)一棵木蘭科植物古旱蓮，北京林業(yè)學院專家用14C 測定其樹齡為400多年，非常具有研究價值。古旱蓮由于其稀有性，在內(nèi)生細菌分離及產(chǎn)酶活性等方面還未見報到。本研究以勉縣武侯祠古旱蓮為研究材料，旨在探究勉縣武侯祠古旱蓮內(nèi)生細菌的物種多樣性，發(fā)掘產(chǎn)酶活性菌株。本研究對進一步深入研究和闡明古旱蓮內(nèi)生細菌的群落分布、物種多樣性及其開發(fā)利用等方面具有理論意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 2015年11月中旬，在陜西省漢中市勉縣武侯祠的工作人員修剪400年生古旱蓮時，采集直徑約為 2 cm的莖組織，放入無菌袋帶回實驗室于4 ℃下保存，材料在2周內(nèi)處理完畢，用于內(nèi)生細菌的分離。

1.1.2 試劑 蛋白胨(純度≥99.5%，天津市盛奧化學試劑有限公司)、酵母粉、NaCl、瓊脂粉(純度≥99.5%，北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司)，2×TaqPCR Master Mix、PCR引物等均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.1.3 儀器 凝膠掃描成像系統(tǒng)(GelDoc，美國Bio-Rad公司)、PCR擴增儀(Mycycler，美國Bio-Rad公司)、移液器系列(Eppendorf，德國Eppendorf公司)。

1.1.4 分離培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g、牛肉粉 5.0 g、NaCl 5.0 g、瓊脂粉12.0 g、水1 L，pH值自然；液體LB培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g、牛肉粉5.0 g、NaCl 10.0 g、水1 L，pH值自然。

1.1.5 酶活性篩選培養(yǎng)基

1.1.5.1 蛋白酶篩選培養(yǎng)基 牛肉粉5.0 g、蛋白胨10.0 g、脫脂高蛋白奶粉20.0 g、NaCl 5.0 g、瓊脂20.0 g、水1 L[11]。

1.1.5.2 淀粉酶篩選培養(yǎng)基 酵母粉5.0 g、蛋白胨5.0 g、可溶性淀粉20.0 g、NaCl 5.0 g、瓊脂20.0 g、水1 L。盧氏碘液[12]。

1.1.5.3 纖維素酶篩選培養(yǎng)基 蛋白胨10.0 g、酵母粉 10.0 g、羧甲基纖維素鈉10.0 g、KH2PO41.0 g、NaCl 5.0 g、瓊脂20.0 g、水1 L[13]。剛果紅染液(1 000 mg/L)，NaCl水溶液(58 500 mg/L)。

1.1.5.4 脂肪酶篩選培養(yǎng)基 蛋白胨10.0 g、(NH4)2SO42.0 g、K2HPO41.0 g、KH2PO43.0 g、FeSO4·7H2O 1.0 g、NaCl 5.0 g、瓊脂20.0 g、水1 L，溴甲酚紫0.04 g[14]，PVA-橄欖油乳化液120 mL。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)生真菌的分離與純化 參照文獻[15]的方法，取新鮮古旱蓮莖組織，用自來水沖洗2 h左右。在超凈工作臺中，用75%乙醇浸泡30 s后，無菌水沖洗5次；然后用0.1%氯化汞浸泡3 min，無菌水沖洗5次。取最后1次無菌水洗滌上清液100 μL，涂布于LB平板，作3個空白對照，37 ℃培養(yǎng)1～3 d，檢測材料表面消毒是否徹底。用無菌剪刀將韌皮部切割成0.5 cm2左右的小塊，接種于LB培養(yǎng)基上，每個平皿內(nèi)接種4個組織塊。封口膜封口，37 ℃倒置培養(yǎng)1～3 d，待材料周圍內(nèi)生細菌長出后，選擇菌落邊緣部分挑取劃線純化，接入液體LB培養(yǎng)基中，在37 ℃、160 r/min條件下培養(yǎng)8 h，轉(zhuǎn)入離心管中，于4 ℃下保存。

1.2.2 分離菌株的系統(tǒng)發(fā)育分析 以細菌通用引物27F/1492R進行菌落PCR，預期擴增長度為1 500 bp，反應體系(30 μL)：2×TaqPCR Mix 15 μL，上下游引物各1 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 12 μL。反應條件：94 ℃變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共33個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠檢測后，由生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。所得序列提交到NCBI數(shù)據(jù)庫中，進行Blast檢索，整理序列，發(fā)往NCBI，獲得菌株登錄號。最后將序列提交到Basic Local Alignment Search Tool (http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行Blast檢索，下載相似性較高的序列數(shù)據(jù)，生成Fasta格式文件。用Clustal-X[16]軟件對所得序列進行人工校正及比對分析。利用MEGA5.1[17]，按照Neighbor-Joining法聚類，選擇1 000個重復做Bootstrap值分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[18]。

1.2.3 多樣性指數(shù) 多樣性指數(shù)(H′)可以反映每種植物內(nèi)生真菌的物種多樣性程度，按Shannon-Weiner指數(shù)計算[19]。

式中：Pi指某種內(nèi)生真菌的菌株數(shù)占全部內(nèi)生真菌菌株數(shù)的百分數(shù)；k表示內(nèi)生真菌菌株數(shù)量。

1.3 胞外酶產(chǎn)生菌的篩選

1.3.1 蛋白酶篩選方法 在無菌條件下，將膜過濾的脫脂高蛋白牛奶加入滅菌后的肉湯培養(yǎng)基中倒平板。穿刺接種后37 ℃培養(yǎng)，待菌落生長到1 cm時測量降解圈直徑。

1.3.2 淀粉酶篩選方法 使用淀粉酶篩選培養(yǎng)基平板，無菌條件下穿刺接種后37 ℃培養(yǎng)，待菌落生長1 cm時緩慢地將盧戈式碘液覆蓋培養(yǎng)基，染色1 min后測量降解圈直徑。

1.3.3 纖維素酶篩選方法 使用纖維素酶篩選培養(yǎng)基平板，無菌條件下穿刺接種后37 ℃培養(yǎng)，待菌落生長1 cm時緩慢加入剛果紅染液(1 000 mg/L)覆蓋培養(yǎng)基染色3 min，再用NaCl水溶液(58 500 mg/L)侵泡脫色3 min后測量降解圈直徑。

1.3.4 脂肪酶篩選方法 按脂肪酶篩選培養(yǎng)基配制培養(yǎng)基，滅菌后加入PVA-橄欖油乳化液120 mL搖勻倒平板，無菌條件下穿刺接種后37 ℃培養(yǎng)，待菌落生長1 cm時，測量黃色降解圈直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生細菌的分離

最后一次沖洗用滅菌去離子水涂布LB平板，37 ℃培養(yǎng)1～3 d，平板上無菌落則表明經(jīng)表面消毒后，樣品表面附生菌影響已消除。共分離純化細菌52株，菌種在4 ℃下保藏。在陜西省漢中市勉縣武侯祠采集古旱蓮材料，在12 h內(nèi)將樣品帶回實驗室并在1周內(nèi)處理，進行內(nèi)生細菌的分離工作，在一定程度上避免了因為人為因素對試驗結(jié)果造成的影響，保證內(nèi)生細菌較為完全的分離。

2.2 分離菌株的系統(tǒng)發(fā)育分析

2.2.1 旱蓮內(nèi)生細菌16S rRNA序列特異性擴增 分離純化旱蓮內(nèi)生細菌，應用細菌16S rRNA序列通用引物進行特異性擴增，得到約1 500 bp的目標片段，見圖1。切膠回收目標條帶可消除非特異性片段的影響。

2.2.2 內(nèi)生細菌的分子生物學鑒定 獲得分離內(nèi)生細菌的登錄號為KR149373～KR149424。本研究較系統(tǒng)地闡述了古旱蓮內(nèi)生細菌的多樣性，采用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法共分離得到古旱蓮內(nèi)生細菌52株，分子生物學歸類為18個屬。根據(jù)測序結(jié)果不同，將菌株歸為19個分類單元(OTUs)，這些菌株分屬4個門，擬桿菌門(Bacteroidetes)下屬1個單元，占總數(shù)的 7.7%，鞘胺醇桿菌屬(Sphingobacteriumsp.)4株；厚壁菌門(Phylum Firmicutes)下屬5個單元，占總數(shù)的15.4%，分別是游動球菌屬(Planococcussp.)1株，葡萄球菌屬(Staphylococcussp.)2株，芽孢桿菌屬(Bacillussp.)3株，類芽孢桿菌屬(Paenibacillussp.)1株，德庫菌屬(Desemziasp.)1株；變形菌門(Proteobacteria)下屬5個單元，占總數(shù)的 19.2%，分別是不動桿菌屬(Acinetobactersp.)3株，假單胞菌屬(Pseudomonassp.)1株，埃希氏菌屬(Escherichiasp.)4株，克雷伯氏菌屬(Klebsiellasp.)1株，克羅諾斯菌屬(Cronobactersp.)1株；放線菌門(Actinobacteria)下屬7個單元，占總數(shù)的40.4%，分別是庫克菌屬(Kocuriasp.)6株，微球菌屬(Micrococcussp.)5株，微桿菌屬(Microbacteriumsp.)3株，短桿菌屬(Brevibacteriumsp.)4株，海迪茨氏菌屬(Dietziasp.)1株，放線菌屬(Actinobacteriumsp.)1株，微球菌科(Micrococcaceae)1株；未培養(yǎng)細菌9株，占總數(shù)的17.3%。在門的分類上，優(yōu)勢菌群為放線菌門(Actinobacteria)，在屬的分類上，優(yōu)勢菌群為庫克菌屬(Kocuriasp.)。古旱蓮內(nèi)生細菌16S rRNA序列同NCBI數(shù)據(jù)庫中相關(guān)序列相似性為 82%～100%，具體見表1。

表1 古旱蓮內(nèi)生細菌16S rRNA基因序列多樣性對比

2.2.3 細菌16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育分析 使用細菌通用引物27F/1492R通過PCR擴增所分離細菌的16S rRNA序列片段，下載相似序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，系統(tǒng)發(fā)育將52個種屬歸為4個門，擬桿菌門包含鞘胺醇桿菌屬1個類群，約占總數(shù)的7.7%；厚壁菌門包含游動球菌屬，葡萄球菌屬，芽孢桿菌屬，類芽孢桿菌屬，德庫菌屬5個類群，約占總數(shù)的15.4%；變形菌門包含不動桿菌屬，假單胞菌屬，埃希氏菌屬，克雷伯氏菌屬，克羅諾斯菌屬5個類群，約占總數(shù)的11.5%；放線菌門包含庫克菌屬，微球菌屬，微桿菌屬，短桿菌屬，海迪茨氏菌屬，放線菌屬，微球菌科7個類群，約占總數(shù)的40.4%，是最優(yōu)勢類群；未培養(yǎng)細菌9株，占總數(shù)的17.3%。

根據(jù)細菌16S rRNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖2。擬桿菌門下屬1個OTU，鞘胺醇桿菌屬的代表菌株HL-B3與未培養(yǎng)細菌的代表菌株HL-B23聚在一處，代表菌株與已知序列的相似度為99%；厚壁菌門下屬5個OTU，游動球菌屬的代表菌株HL-B8與葡萄球菌屬的代表菌株HL-B28、芽孢桿菌屬的代表菌株HL-B29、類芽孢桿菌屬的代表菌株HL-B44、德庫菌屬的代表菌株HL-B54在進化樹上聚在一處，代表菌株與已知序列的相似度在97%以上；變形菌門下屬5個OTUs，不動桿菌屬的代表菌株HL-B11與假單胞菌屬的代表菌株HL-B16、埃希氏菌屬的代表菌株HL-B30、克雷伯氏菌屬的代表菌株HL-B75、克羅諾斯菌屬的代表菌株HL-B65在進化樹上聚在一處，代表菌株與已知序列的相似度為99%；放線菌門下屬7個OTUs，庫克菌屬的代表菌株HL-B6與微球菌屬的代表菌株HL-B7、微桿菌屬的代表菌株HL-B14、短桿菌屬的代表菌株HL-B18、海迪茨氏菌屬的代表菌株HL-B67、放線菌屬的代表菌株HL-B72、微球菌科的代表菌株HL-B81在進化樹上聚在一處，代表菌株與已知序列的相似度在82%以上。

2.2.4 古旱蓮內(nèi)生細菌的多樣性指數(shù) 根據(jù)多樣性指數(shù)公式，計算古旱蓮內(nèi)生細菌的多樣性指數(shù)為2.666 6。多樣性指數(shù)越高說明物種的多樣性越豐富。Klopper等的研究采用4種不同的培養(yǎng)基分離木蘭科植物內(nèi)生真菌，多樣性指數(shù)在 1.33～1.81之間[20]，與本研究相比，古旱蓮內(nèi)生細菌的多樣性是十分豐富的。

2.3 胞外酶產(chǎn)生菌的篩選

產(chǎn)蛋白酶菌株篩選：將純培養(yǎng)后的單菌落菌液穿刺接種至蛋白酶篩選培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)12 h，得到分解透明圈即是產(chǎn)蛋白酶菌株，共22株。

產(chǎn)淀粉酶菌株篩選：將純培養(yǎng)后的單菌落菌液穿刺接種至淀粉酶篩選培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)12 h，使用盧氏碘液染色，可見白色透明圈即是產(chǎn)淀粉酶菌株，共3株。

產(chǎn)纖維素酶菌株篩選：將純培養(yǎng)后的單菌落菌液穿刺接種至纖維素酶篩選培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)12 h，使用剛果紅(1 000 mg/L)染液染色5 min，再用NaCl(58 500 mg/L)脫色5 min。得到的透明圈即是產(chǎn)纖維素酶菌株，共7株。

產(chǎn)脂肪酶菌株篩選：將純培養(yǎng)后的單菌落菌液穿刺接種至脂肪酶篩選培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)12 h，菌落產(chǎn)生的脂肪酶將脂肪降解為脂肪酸使溴甲基紫變?yōu)辄S色，即是產(chǎn)脂肪酶菌株，共4株，結(jié)果見表2。

3 結(jié)論與討論

藥用植物內(nèi)生細菌的研究日漸增多，如紅豆杉[20]、苦豆子[21]、沙冬青[22]等，但對木蘭科植物內(nèi)生細菌的研究依舊較少。本研究發(fā)現(xiàn)，古旱蓮分離內(nèi)生細菌52個株，可歸為4個門，擬桿菌門包含鞘胺醇桿菌屬1個類群，約占總數(shù)的 7.7%；厚壁菌門包含游動球菌屬、葡萄球菌屬、芽孢桿菌屬、類芽孢桿菌屬、德庫菌屬5個類群，約占總數(shù)的15.4%；變形菌門包含不動桿菌屬、假單胞菌屬、埃希氏菌屬、克雷伯氏菌屬、克羅諾斯菌屬5個類群，約占總數(shù)的11.5%；放線菌門包含庫克菌屬、微球菌屬、微桿菌屬、短桿菌屬、海迪茨氏菌屬、放線菌屬、微球菌科7個類群，約占總數(shù)的40.4%，是最優(yōu)勢類群；未培養(yǎng)細菌9株，占總數(shù)的17.3%。本研究分離到的細菌以放線菌為最優(yōu)勢類群，這可能與試驗材料，培養(yǎng)基等因素相關(guān)。本研究分離到9株未培養(yǎng)菌，分類地位目前不明確，有待于進一步的研究。利用傳統(tǒng)方法研究植物內(nèi)生菌分離得到的內(nèi)生菌數(shù)量及種類是有限的，須要結(jié)合免培養(yǎng)方法才能更為有效地了解植物內(nèi)生菌的群落結(jié)構(gòu)。目前國內(nèi)外對植物內(nèi)生菌資源的研究取得了一定的進展，但相對于我國豐富的藥用植物資源來說，對其內(nèi)生菌資源的開發(fā)和利用還是遠遠不夠的[23]。

據(jù)統(tǒng)計我國藥用植物有11 146種，藥用植物作為一類特殊的植物其內(nèi)生環(huán)境具有一定的特殊性[24]。全面系統(tǒng)地對藥用植物內(nèi)生菌資源及其活性代謝產(chǎn)物進行研究是非常有必要的。研究植物內(nèi)生細菌的目的在于應用，自黃瓜、棉花等植物體內(nèi)的細菌和宿主植物的抗病能力關(guān)系[22]被發(fā)表以來，很多研究人員開始致力于植物體內(nèi)的細菌研究，至今在植物保護方面積累了大量的植物內(nèi)生細菌研究信息[23-25]。本研究分離到的內(nèi)生細菌與植物之間的關(guān)系還需要進一步深入探討。

植物內(nèi)生細菌研究的另一個熱點則在生理活性物質(zhì)研究領(lǐng)域[26]。分離自古旱蓮中的內(nèi)生細菌有一部分能夠分泌胞外淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶和脂肪酶，而且有些菌株還具有同時分泌其中2種水解酶的能力，這種產(chǎn)酶特性可能與其適應獨特的生活環(huán)境有關(guān)。目前已經(jīng)從木蘭科植物五味子中分離出內(nèi)生拮抗細菌[27-28]。本研究鑒定的3株高產(chǎn)酶活性菌株中，1株產(chǎn)淀粉酶為類芽孢桿菌，2株產(chǎn)蛋白酶為微桿菌，說明古旱蓮內(nèi)生類芽孢桿菌和微桿菌可能具有重要的工業(yè)酶開發(fā)價值。

表2 古旱蓮內(nèi)生細菌產(chǎn)酶活性篩選

注：+表示0～2 cm；++表示2～5 cm；+++表示 >5 cm；-表示無結(jié)果。

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