劉 琳

(青島農(nóng)業(yè)大學生命科學學院山東省應用真菌重點實驗室，山東青島 266109

白藜蘆醇是一種重要的植物抗毒素，具有抗癌、抗病毒等多種功效，在美國、日本等國家被列為保健品，在我國白藜蘆醇被制成膠囊，用于調節(jié)血脂和抗癌治療[1-4]。目前，國際市場上對白藜蘆醇的需求量與日俱增。白藜蘆醇的主要生產(chǎn)方法是從植物虎杖(PolygonumcuspidatumSieb. et Zucc)中提取，在生產(chǎn)過程中產(chǎn)生大量藥渣，僅2010年，我國虎杖藥渣總量就達2.6萬t[5]。部分白藜蘆醇殘留在藥渣中，造成資源浪費。田鳳等報道，水提虎杖藥渣中殘留的白藜蘆醇含量達到原藥材總量的47%[5]。更為重要的是，這些藥渣大多作為廢棄物集中堆放、掩埋，或曬干后焚燒處理，造成嚴重的環(huán)境污染[6]，而有關虎杖藥渣綜合利用的研究卻鮮有報道。朱杰等利用虎杖藥渣栽培杏鮑菇，杏鮑菇中白藜蘆醇含量僅為 4.91 μg/g，產(chǎn)品附加值較低[7]。

樺褐孔菌[Inonotusobliquus(Fr.) Pilat]是一種非常珍貴的藥用真菌，早在16世紀，歐洲國家已將其應用于治療癌癥、結核病、糖尿病等疑難雜癥[8-9]。多糖是樺褐孔菌的重要活性成分，具有抗炎、抗腫瘤、降血糖等多種生理活性[10-11]。然而，野生樺褐孔菌資源十分稀少，價格昂貴，遠不能滿足市場需求。液體深層發(fā)酵是樺褐孔菌多糖的主要來源途徑，同時樺褐孔菌菌絲體含有豐富的人體必需氨基酸，具有較高的營養(yǎng)價值[12]。近年來，對于樺褐孔菌多糖的研究主要集中在藥理活性和發(fā)酵常規(guī)碳、 氮源的優(yōu)化。筆者利用樺褐孔菌發(fā)酵

虎杖藥渣生成樺褐孔菌多糖，采用單因素和正交試驗獲得了最優(yōu)培養(yǎng)基組成。同時，樺褐孔菌將虎杖藥渣中殘留的白藜蘆醇轉化、釋放。該方法利用虎杖藥渣同時獲得高附加值產(chǎn)品樺褐孔菌多糖、白藜蘆醇和樺褐孔菌菌絲體，不僅具有較高的經(jīng)濟效益，還能夠緩解虎杖藥渣引起的環(huán)境污染，產(chǎn)生良好的社會效益。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樺褐孔菌取自青島農(nóng)業(yè)大學山東省應用真菌重點實驗室；葡萄糖、苯酚、硫酸等試劑均為分析純；乙腈為色譜純。

恒溫振蕩器購自上海一恒科學儀器有限公司；電子天平購自奧豪斯國際貿易有限公司；752紫外可見分光光度計購自上海舜宇恒平科學儀器有限公司；臺式離心機購自賽默飛世爾科技有限公司；高效液相色譜Waters 2690色譜系統(tǒng)購自Waters公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基：KH2PO43 g/L、MgSO415 g/L、蛋白胨5 g/L、葡萄糖20 g/L、5 g/L麩皮浸汁。

基礎發(fā)酵培養(yǎng)基：KH2PO43 g/L、MgSO41.5 g/L、蛋白胨5 g/L、虎杖藥渣20 g/L、5 g/L麩皮浸汁。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng) 種子培養(yǎng)：將4 ℃冰箱中的PDA斜面菌種轉接于PDA平板，28 ℃活化培養(yǎng)5 d。在平板中菌絲生長旺盛處打孔，每個種子培養(yǎng)基中接入3個菌塊，發(fā)酵培養(yǎng)(28 ℃，120 r/min，3 d)，250 mL三角瓶種子培養(yǎng)基裝液量 50 mL。發(fā)酵培養(yǎng)：將種子培養(yǎng)基以接種量8%(v/v)接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，250 mL三角瓶裝液量50 mL，28 ℃、120 r/min條件下培養(yǎng)7 d，檢測發(fā)酵液中的多糖含量。

1.2.3 單因素試驗

1.2.3.1 麩皮添加量的確定 麩皮浸汁的制備：稱取一定質量的麩皮，加入適量自來水，煮沸30 min后用紗布過濾，棄濾渣，濾液定容。制備麩皮添加量分別為5、10、20、30 g/L的麩皮浸汁，利用不同的麩皮浸汁配制培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中其他組分及添加量與基礎發(fā)酵培養(yǎng)基相同。發(fā)酵培養(yǎng)結束后，4 000 r/min 離心15min，上清液用蒸餾水定容至50 mL，檢測多糖含量，確定最適麩皮添加量。發(fā)酵培養(yǎng)方法同“1.2.2”節(jié)。

1.2.3.2 碳源的確定 發(fā)酵培養(yǎng)基中添加10 g/L的虎杖藥渣，在此基礎上分別添加麥芽糖、葡萄糖、蔗糖和玉米粉，添加量為10 g/L。培養(yǎng)基中其他組分及添加量與基礎發(fā)酵培養(yǎng)基相同。發(fā)酵結束后，檢測多糖含量，確定最適碳源。發(fā)酵培養(yǎng)方法同“1.2.2”節(jié)。

1.2.3.3 虎杖藥渣添加量的確定 改變基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中虎杖藥渣添加量為5、10、15、20 g/L，培養(yǎng)基中其他組分及添加量與基礎發(fā)酵培養(yǎng)基相同。發(fā)酵結束后，檢測多糖含量，確定最適虎杖藥渣添加量。發(fā)酵培養(yǎng)方法同“1.2.2”節(jié)。

1.2.3.4 氮源的確定 分別用豆粕、牛肉膏、酵母膏、(NH4)2SO4代替基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中的蛋白胨配制發(fā)酵培養(yǎng)基，各種氮源添加量均為0.5%。發(fā)酵結束后，檢測多糖含量，確定最適氮源。發(fā)酵培養(yǎng)方法同“1.2.2”節(jié)。

1.2.4 分析方法

1.2.4.1 苯酚-硫酸法檢測多糖含量 發(fā)酵結束后，4 000 r/min 離心15 min，取發(fā)酵液上清用蒸餾水定容至 50 mL。取發(fā)酵液上清10 mL，加入4倍體積的無水乙醇，放于4 ℃冰箱中過夜沉降，6 000 r/min離心5 min，棄上清，取沉淀加入10 mL蒸餾水溶解，即為多糖提取液。取多糖提取液1.0 mL于試管中，加入6.0%的苯酚溶液1.0 mL、濃硫酸 5.0 mL，用微型旋渦混合儀搖勻，迅速用流水冷卻至室溫，在490 nm處檢測吸光度，根據(jù)標準曲線計算多糖含量。標準曲線方程為y=6.214 9x+0.003 3，r2=0.999 7。

1.2.4.2 白藜蘆醇含量 發(fā)酵結束后，向三角瓶中加入無水乙醇，使乙醇最終體積分數(shù)為70%，冷浸提12 h，取上清，HPLC檢測白藜蘆醇的含量。色譜柱為Kromasil-C18ID 4.6 mm×250 mm，5 μm，流速為0.7 mL/min，柱溫為室溫，流動相為水和乙腈。梯度洗脫：0～15 min，乙腈/水(v/v)31 ∶69～50 ∶50；15～20 min，乙腈/水(v/v)50 ∶50～98 ∶2。檢測波長為306 nm。

1.2.4.3 樺褐孔菌菌絲體生物量 發(fā)酵結束后，4 000 r/min離心10 min后收集菌絲體，60 ℃干燥至恒質量，稱質量。

2 結果與分析

2.1 麩皮添加量的確定

由圖1可知，添加麩皮后，多糖產(chǎn)量較空白對照明顯增加。隨著麩皮浸汁中麩皮添加量從5 g/L增加到30 g/L，多糖的產(chǎn)量先增加后減少，當麩皮添加量為1.0%時，多糖產(chǎn)量最高，為(6.87±0.29) g/L。樺褐孔菌是白腐菌，能夠同時分泌纖維素酶和木質素降解酶，比霉菌更適合水解天然木質纖維素[13]。纖維素和木質素是虎杖藥渣中的主要成分，發(fā)酵液中纖維素酶和木質素降解酶的活力越高，越有利于虎杖的降解。麩皮中含有低聚葡萄糖、纖維二糖等誘導物質，能夠促進菌體產(chǎn)生大量的纖維素酶和木質素降解酶[14-15]。所以，在培養(yǎng)基中適當?shù)靥砑欲熎び欣诨⒄鹊慕到夂投嗵堑暮铣桑囵B(yǎng)基中麩皮過多則對酶的活性具有抑制作用[16]，反而不利于多糖的合成。因此，最適麩皮添加量為10 g/L。

2.2 碳源的確定

為了進一步提高多糖產(chǎn)量，在含有10 g/L虎杖藥渣的培養(yǎng)基中分別添加4種補充碳源，添加量為10 g/L。以基礎發(fā)酵培養(yǎng)基作對照，考察混合碳源對多糖生成的影響(圖2)。當麥芽糖、蔗糖、葡萄糖與虎杖的混合物作為碳源時，多糖產(chǎn)量分別為對照(虎杖藥渣)的60.59%，59.06%、49.69%；玉米粉作為補充碳源，獲得的多糖[(4.70±0.21) g/L]與對照[(4.72±0.19) g/L]相差不大。向超等的研究表明，葡萄糖、蔗糖和麥芽糖作為碳源，比玉米粉更有利于樺褐孔菌菌絲體和樺褐孔菌三萜的積累[17]。然而，在樺褐孔菌發(fā)酵虎杖藥渣合成多糖的培養(yǎng)基中，添加這3種速效碳源的效果不如玉米粉。雖然虎杖藥渣作為主要碳源(對照)與虎杖和玉米粉的混合碳源相比，獲得的多糖產(chǎn)量相差不大，但考慮到虎杖藥渣的廢物利用，確定碳源為虎杖藥渣。

2.3 虎杖藥渣添加量的確定

虎杖藥渣作為主要的碳源，在培養(yǎng)基中的含量是影響樺褐孔菌多糖積累的重要因素。由圖3可知，多糖的產(chǎn)量隨著虎杖藥渣添加量的增加先增加后減少，當培養(yǎng)基中虎杖藥渣添加量為15 g/L時，多糖產(chǎn)量最高，為(6.93±0.24) g/L。當培養(yǎng)基中虎杖藥渣添加量超過15 g/L時，多糖產(chǎn)量降低，這是因為虎杖中的多種組分具有一定的抑菌作用[18]，如蒽醌衍生物能夠與DNA結合，抑制菌體DNA、RNA以及蛋白質的生物合成；鞣質能使微生物原生質凝固。過量的虎杖藥渣抑制了樺褐孔菌的生長，導致多糖產(chǎn)量降低。因此，最適虎杖藥渣添加量為1.5%。

2.4 氮源的確定

不同氮源對樺褐孔菌發(fā)酵虎杖生成多糖的影響見圖4。由圖4可知，蛋白胨作為氮源的發(fā)酵液中多糖含量最高，為(4.74±0.29) g/L，牛肉膏次之，為(3.03±0.18) g/L。豆粕和(NH4)2SO4作為氮源不利于樺褐孔菌發(fā)酵合成多糖，多糖量分別為(0.57±0.16) g/L和(0.36±0.13) g/L，這與張澤生等[19]和周麗潔等[20]的研究結果一致。因此，確定蛋白胨為最適氮源。

改變培養(yǎng)基的蛋白胨添加量，考察氮源濃度變化對多糖產(chǎn)量的影響(圖5)。由圖5可知，蛋白胨添加量從2 g/L增加到15g/L時，多糖產(chǎn)量先增大后減少。蛋白胨含量從2 g/L 增加到5 g/L時，多糖產(chǎn)量由(2.13±0.21) g/L增加到(4.74±0.19) g/L；蛋白胨含量從5 g/L到8 g/L時，多糖量變化不大；蛋白胨含量從8 g/L到15 g/L時，多糖產(chǎn)量下降為(1.63±0.27) g/L。因此，確定發(fā)酵培養(yǎng)基中蛋白胨的最適添加量為5 g/L。

2.5 正交試驗優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基

以麩皮、虎杖藥渣和蛋白胨的添加量為3個因素，各取3個水平，以多糖產(chǎn)量為指標，選L9(33)正交表進行試驗，優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基(表1)。正交試驗極差分析結果(表2)表明，培養(yǎng)基中影響多糖產(chǎn)量的因素主次順序為B>A>C，即虎杖藥渣添加量>麩皮添加量>蛋白胨添加量。3個因素的最優(yōu)水平組合為A2B2C2，即虎杖藥渣添加量為15 g/L，麩皮添加量為10 g/L，蛋白胨添加量5 g/L。因此，樺褐孔菌發(fā)酵虎杖藥渣生成多糖的優(yōu)化培養(yǎng)基為KH2PO43 g/L、MgSO41.5 g/L、蛋白胨5 g/L、虎杖藥渣15 g/L、麩皮浸汁10 g/L，pH值自然。此條件下，多糖產(chǎn)量為(7.65±0.21) g/L。正交試驗方差分析結果(表3)表明，麩皮添加量和虎杖藥渣添加量對多糖產(chǎn)量的影響顯著。根據(jù)F值可知，影響多糖產(chǎn)量的因素主次順序與極差分析結果一致。

表1 虎杖藥渣生成多糖培養(yǎng)基優(yōu)化的正交試驗因素水平

2.6 白藜蘆醇和樺褐孔菌菌絲體的獲得

利用正交試驗獲得的發(fā)酵培養(yǎng)基進行發(fā)酵培養(yǎng)，HPLC法(高效液相色譜法)檢測出發(fā)酵液中白藜蘆醇含量為(1.62±0.14)mg/g虎杖干藥渣， 樺褐孔菌菌絲體生物量為(11.79±0.35) g/L。在虎杖中，白藜蘆醇主要以白藜蘆醇苷的形式存在，白藜蘆醇苷由白藜蘆醇和葡萄糖通過β-葡萄糖苷鍵連接構成。纖維素酶中的β-葡萄糖苷酶能夠將白藜蘆醇苷轉化為白藜蘆醇[21]。樺褐孔菌分泌纖維素酶，在利用虎杖藥渣的同時，將白藜蘆醇苷轉化為白藜蘆醇。樺褐孔菌菌絲體含有豐富的人體必需氨基酸，在保健食品領域中具有廣闊的應用前景。

表2 虎杖藥渣生成多糖培養(yǎng)基優(yōu)化的正交試驗結果(n=3)

表3 虎杖藥渣生成多糖培養(yǎng)基優(yōu)化的正交試驗方差分析

3 結論

本試驗利用樺褐孔菌發(fā)酵虎杖藥渣生成樺褐孔菌多糖。通過單因素試驗確定發(fā)酵培養(yǎng)基中最適麩皮添加量為 10 g/L，最適虎杖藥渣添加量為15 g/L，最適氮源為蛋白胨，添加量為5 g/L。在此基礎上，采用正交試驗優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基。最優(yōu)培養(yǎng)基組成為KH2PO43 g/L，MgSO41.5 g/L，蛋白胨 5 g/L，虎杖藥渣15 g/L，10 g/L麩皮浸汁。此條件下，多糖產(chǎn)量為(7.65±0.21) g/L，白藜蘆醇為(1.62±0.14) mg/g，樺褐孔菌菌體生物量為(11.79±0.35) g/L。該方法以虎杖藥渣廢棄物作為主要碳源，變廢為寶，原料利用度高，發(fā)酵廢渣少，發(fā)酵產(chǎn)品價值高，具有可觀的社會效益、經(jīng)濟效益和產(chǎn)業(yè)化前景。