丁麗軍， 陳林中日， 龐艷華， 雷偉偉， 張雨梅

(1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇泰州 225300； 2.揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚州 225009

糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)又稱糞鏈球菌，是人和動物腸道內(nèi)主要菌群之一[1]，在動物腸道內(nèi)可形成生物薄膜附著于動物腸道黏膜上，并且生長、發(fā)育和繁殖。我國《飼料添加劑品種目錄(2013)》將糞腸球菌規(guī)定為可以添加到飼料中的菌種。糞腸球菌能夠?qū)暳现械睦w維變軟，提高飼料的轉(zhuǎn)化率。研究發(fā)現(xiàn)在玉米秸稈青貯飼料中添加糞腸球菌和纖維素酶，能使青貯飼料的色澤、氣味和質(zhì)地等發(fā)生明顯的改善，干物質(zhì)消化率提高8%，氨態(tài)氮與總氮質(zhì)量比降低33%，丁酸質(zhì)量分數(shù)降低82%，明顯提高了飼料品質(zhì)[2]。飼糧中添加糞腸球菌具有提高動物生產(chǎn)性能、改善營養(yǎng)物質(zhì)代謝和提高免疫功能等作用[3-5]。糞腸球菌能夠產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)，這些抗菌物質(zhì)對沙門氏菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌等致病菌具有良好的抑制作用[6-8]。糞腸球菌作為益生菌在畜禽上的研究和應(yīng)用也越來越多。本研究擬通過小鼠骨髓細胞微核試驗、小鼠精子畸形試驗，探討蛋白質(zhì)修飾糞腸球菌在體內(nèi)的致突變作用，為該糞腸球菌的應(yīng)用安全性評價提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

受試物蛋白質(zhì)修飾糞腸球菌粉，由江蘇省某生物技術(shù)公司研制，5×109CFU/g，批號20141206。臨用前配成所需濃度的水溶液。

ICR小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量(22±2) g，共70只；ICR雄性小鼠，體質(zhì)量(28±2) g，共50只，購自揚州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(蘇)2012-0004，使用許可證號：SYXK(蘇)2012-0029。飼喂經(jīng)60Co照射飼料，自然光照，室溫 (24±2) ℃，濕度(60±20)%，自由采食和飲水，飲水為符合城市飲用水標準的自來水。

pH值6.47磷酸緩沖液配制：稱取Na2HPO4·12H2O 23.88 g，溶于1 000 mL蒸餾水，為甲液；稱取KH2PO49.08 g溶于1 000 mL蒸餾水，為乙液。取甲液30 mL和乙液70 mL混合即為pH值6.47磷酸緩沖液。

姬姆薩(Giemsa)染液：取1.5 g姬姆薩原粉，加50 mL甘油，置于60 ℃溫箱，約3 h后溶解。取出后加入50 mL甲醇，即為母液。使用前將母液與pH值6.47磷酸緩沖液按1 ∶10的比例混合成工作液。

1.2 方法

1.2.1 急性毒性試驗 預(yù)試驗中，小鼠劑量高達10 g/kg(按體質(zhì)量計，下同)時均無死亡，說明受試物毒性較小，根據(jù)急性毒性操作規(guī)程，進行最大給藥量試驗。小鼠20只，雌、雄各半，24 h內(nèi)灌胃2次，給予總劑量為10 g/kg。小鼠灌胃前，禁食12 h，自由飲水。灌胃后，繼續(xù)停食1 h，觀察動物的反應(yīng)情況7～14 d，并記錄中毒癥狀或死亡數(shù)。

1.2.2 小鼠骨髓細胞微核試驗

1.2.2.1 染毒 受試物3個劑量組分別為5、2、1 g/kg。另設(shè)陰性對照組和環(huán)磷酰胺陽性對照組，陰性對照組經(jīng)口給予生理鹽水，陽性對照組給予80 mg/kg環(huán)磷酰胺一次性腹腔注射。受試物采用不同濃度等體積灌胃，0.2 mL/10 g體質(zhì)量。染毒2次，時間間隔24 h。每組10只小鼠，雌雄各半，在第二次灌胃后6 h，脫頸椎處死小鼠。

1.2.2.2 制片染色 取小鼠兩側(cè)股骨，剪去股骨兩端。用小牛血清0.05 mL沖洗骨髓腔，于載玻片上推勻，晾干。涂片經(jīng)甲醇固定5～10 min，晾干后，姬姆薩染液染色20 min。蒸餾水沖洗，干燥，鏡檢。

1.2.2.3 鏡檢及微核細胞計數(shù) 油鏡下可見嗜多染紅細胞(PCE)呈灰藍色，成熟的正染紅細胞(NCE)呈粉紅色。計數(shù)每只小鼠1 000個PCE中具有微核的細胞數(shù)，計算微核率。微核率=有微核的PCE總數(shù)/檢查的PCE總數(shù)×1000‰，微核率以‰表示。另外計數(shù)200個紅細胞中的PCE和NCE數(shù)，求出PCE/NCE的值。

1.2.2.4 結(jié)果判定 若微核率統(tǒng)計結(jié)果差異顯著(P<0.05)并有劑量反應(yīng)關(guān)系時判為陽性，反之則為陰性。PCE/NCE的比值應(yīng)在0.6～1.2的范圍內(nèi)。若比值小于0.1，則表示PCE形成受到嚴重抑制；若比值小于0.05，則表示受試物劑量過大，試驗結(jié)果不可靠。

1.2.3 小鼠精子畸形試驗

1.2.3.1 染毒劑量途經(jīng) ICR雄性小鼠，每組10只，每天染毒1次，連續(xù)5 d。受試物水溶液灌胃給予，灌胃體積為 0.2 mL/10 g體質(zhì)量，劑量分別為5、2、1 g/kg；另以40 mg/kg環(huán)磷酰胺腹腔注射為陽性對照，生理鹽水灌胃為陰性對照。

1.2.3.2 觀察 于第一次給予受試物后35 d脫頸椎處死小鼠，取兩側(cè)附睪制成精子懸液，涂片、晾干后，2%伊紅染色、鏡檢。每只小鼠觀察1 000個精子，計數(shù)畸形精子數(shù)，計算精子畸形率并分析畸形類別。

1.2.3.3 結(jié)果判定 出現(xiàn)可重復(fù)的劑量-反應(yīng)關(guān)系時，可判定試驗結(jié)果為陽性。即至少有2個相鄰劑量組的精子畸形率比陰性對照組極顯著增高(P<0.01)；或達到陰性對照組的2倍及以上，并且試驗結(jié)果可重復(fù)，則可認為試驗結(jié)果陽性；反之則為陰性。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用SPSS 12.0，顯著性比較采用χ2分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠急性毒性試驗

試驗中當劑量高達10 g/kg時小鼠均無死亡。因此，受試物小鼠經(jīng)口LD50>10 g/kg。根據(jù)WHO關(guān)于外源化學(xué)物急性毒性分級標準，當LD50>5 000 mg/kg時為實際無毒級別，故受試物蛋白質(zhì)修飾糞腸球菌屬于實際無毒物質(zhì)。

2.2 小鼠骨髓細胞微核試驗

微核率和PCE/NCE統(tǒng)計結(jié)果見表1。各試驗組 PCE/NCE 比值在正常范圍內(nèi)，說明本試驗方法可行。陽性對照組與陰性對照組比較差異極顯著(P<0.01)。受試物各試驗組微核率與陽性對照組比較差異極顯著(P<0.01)；與陰性對照組比較差異不顯著(P>0.05)，且各試驗組微核率之間無劑量-反應(yīng)關(guān)系。根據(jù)微核試驗判定標準，受試小鼠骨髓細胞微核試驗結(jié)果為陰性。

表1 蛋白質(zhì)修飾糞腸球菌微核率和PCE/NCE統(tǒng)計

注：*表示與陰性對照組比較差異極顯著(P<0.01)；#表示與陽性對照組比較差異極顯著(P<0.01)。表2同。

2.3 小鼠精子畸形試驗

受試物小鼠精子畸形試驗結(jié)果見表2和表3。陽性對照組精子畸形率顯著高于陰性對照組(P<0.01)。受試物3個劑量組的精子畸形率與陰性對照組比較，無顯著性差異(P﹥0.05)。受試物精子畸形類別與陽性對照組相似，畸形主要以無鉤、香蕉形、無定形及胖頭4種為主，占90%以上，其他類別所占例較小。受試物小鼠精子畸形試驗結(jié)果為陰性，表明蛋白球菌對小鼠的生殖細胞無明顯的致突變性。

表2 蛋白質(zhì)修飾糞腸球菌小鼠精子畸形試驗率

表3 蛋白質(zhì)修飾糞腸球菌小鼠精子畸形類別統(tǒng)計

3 結(jié)論與討論

受試物小鼠骨髓細胞微核試驗陰性、小鼠精子畸形試驗陰性，說明受試物在體內(nèi)對體細胞和生殖細胞無明顯的致突變作用。

本課題組進行的受試物對鼠傷寒沙門氏菌突變試驗的結(jié)果也為陰性(此部分內(nèi)容另文發(fā)表)。因此，受試物在體外Ames試驗、體內(nèi)小鼠骨髓細胞微核試驗和小鼠精子畸形試驗中均為陰性結(jié)果，說明蛋白質(zhì)修飾糞腸球菌無致突變作用。

由于受試物L(fēng)D50大于10 g/kg，小鼠骨髓細胞微核試驗和小鼠精子畸形試驗中的劑量5、2、1 g/kg，是按照1/2 LD50、1/5 LD50和1/10 LD50設(shè)置的。雖然試驗劑量相對較大，但小鼠骨髓細胞微核試驗和小鼠精子畸形試驗的結(jié)果仍然為陰性。