朱秀輝， 丁 丹， 茹淑玲， 檀 笑， 解啟來， 鄧春軍， 曾巧云

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，廣東廣州 510642； 2.環(huán)境保護(hù)部華南環(huán)境科學(xué)研究所，廣東廣州 510655

抗生素作為促生長(zhǎng)劑和預(yù)防、治療人類及畜禽等動(dòng)物疾病的特效抗菌藥而在全球范圍內(nèi)廣泛使用。但這些抗菌藥有 30%～90% 不能被機(jī)體的組織細(xì)胞吸收，以藥物原液或其代謝物的形成隨糞便排出[1]。畜禽糞便作為有機(jī)肥料是目前改善耕作土壤的主要和最有前景的方法之一[2]，廣泛應(yīng)用于果蔬生產(chǎn)?？股剡M(jìn)入土壤后易被吸附而長(zhǎng)期滯留，危害環(huán)境和生態(tài)系統(tǒng)，干擾生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)[3-4]，降低土壤肥力，甚至?xí)晦r(nóng)作物吸收富集[5-6]而危害農(nóng)產(chǎn)品安全。

四環(huán)素類抗生素(TCs)是一種使用非常普遍、價(jià)格低廉、副作用小且強(qiáng)有效的人畜共用抗菌藥。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2013年我國(guó)抗生素的總產(chǎn)量達(dá)248 000 t，消耗總量達(dá)162 000 t，其中用于動(dòng)物的消耗量為84 240 t，用于人類的消耗量為77 760 t[7]。白菜是人們最常食用的蔬菜且被大面積種植，它具有對(duì)污染物敏感、易于栽培、生命周期短等特性，常被用作評(píng)價(jià)生態(tài)毒性的受試植物[8-9]。因此，本研究選擇常用的3種四環(huán)素類抗生素[四環(huán)素(TC)、土霉素(OTC)和金霉素(CTC)]，研究鈣離子(Ca2+)與四環(huán)素類抗生素單體、復(fù)合溶液以及廣東省廣州市北郊供試土壤解吸液對(duì)白菜(Brassicacampestrisssp.chinensis)種子的萌發(fā)、根和芽伸長(zhǎng)的影響，旨在評(píng)價(jià)復(fù)雜體系四環(huán)素類抗生素對(duì)生態(tài)環(huán)境的影響，為其風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

3種四環(huán)素類抗生素：四環(huán)素、金霉素和土霉素，均購(gòu)買于CATO(美國(guó))，純度均>96.2%。CaCl2、次氯酸鈉溶液等試劑購(gòu)買于廣州化學(xué)試劑廠。白菜種子購(gòu)買于當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)上的種子公司。

1.2 儀器設(shè)備

本試驗(yàn)所用儀器設(shè)備包括培養(yǎng)箱、離心機(jī)、高壓滅菌鍋、直徑90 mm的玻璃培養(yǎng)皿、容量瓶(50、100 mL)、10 mL 量筒、10 mL移液管、100 mL燒杯、溫度計(jì)、玻璃棒、鑷子、剪刀、刻度尺、保鮮膜、紗布、定性濾紙(90 mm定性濾紙)。

1.3 樣品采集

供試土壤采集于廣東省廣州市北郊區(qū)域典型蔬菜基地，均為0～20 cm土層樣品，風(fēng)干磨細(xì)過60目篩，經(jīng)檢測(cè)后篩選

不含3種目標(biāo)抗生素的土壤樣品。供試土壤地理位置：113°17′46″E、23°29′16″N，理化性質(zhì)：全氮含量為1.70 g/kg，有機(jī)質(zhì)含量為36.55 g/kg，有效磷含量為21.78 mg/kg，速效鉀含量為 108.91 mg/kg，pH值為7.28，陽(yáng)離子交換量(CEC)為 9.13 cmol/kg。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 解吸液的獲取 參照OECD guideline 106(2000)批量平衡法對(duì)供試土壤進(jìn)行吸附解吸試驗(yàn)，準(zhǔn)確稱取若干份相同質(zhì)量的土樣0.500 0 g(精確至0.499 5～0.500 5 g)于100 mL玻璃離心管中，高壓濕法間歇滅菌3次(121 ℃，100 kPa，20 min)，烘箱中于60 ℃烘干；加入過濾法滅菌的CTC、OTC溶液及背景電解質(zhì)溶液CaCl2，使最終溶液體積為20 mL，CaCl2溶液濃度為0.01 mol/L。系列TC、CTC、OTC濃度均為 1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 mg/L。旋渦混勻，在(25±1) ℃及150 r/min條件下，于恒溫振蕩箱中黑暗條件下振蕩24 h，之后在4 500 r/min條件下離心10 min，去其上清液。然后重新加入0.01 mol/L CaCl2溶液20 mL，繼續(xù)振蕩24 h，離心后取其上清液供后續(xù)試驗(yàn)。以上處理均做3個(gè)重復(fù)，其中不含抗生素的處理作為空白，不含土壤的處理作為對(duì)照(CK)。

1.4.2 種子發(fā)芽率試驗(yàn) 4種供試液CaCl2溶液、抗生素溶液、含0.01 mol/L CaCl2抗生素溶液及解吸溶液均用去離子水配制。CaCl2溶液濃度設(shè)置為5×10-5、1.0×10-4、2.0×10-4、1.0×10-3、2.5×10-3、1.0×10-2mol/L(0.01 mol/L)，抗生素溶液和含0.01 mol/L CaCl2的抗生素溶液的濃度設(shè)置同吸附解吸試驗(yàn)濃度，以去離子水為對(duì)照(CK)。

將白菜種子在0.2%次氯酸鈉溶液中浸泡消毒15 min，然后用去離子水沖洗3～5遍。在40 ℃溫水中浸泡種子 2～3 h直至水冷，重復(fù)2次，白菜種子發(fā)芽試驗(yàn)采用保濕培養(yǎng)法，取2層滅菌后的濾紙平鋪在玻璃培養(yǎng)皿(直徑D=90 mm)中，吸取10 mL供試溶液后，將篩選好的種子隨機(jī)取20 粒平放在濾紙上，設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。在黑暗(可防止抗生素發(fā)生光水解)的培養(yǎng)箱內(nèi)于25 ℃ 培養(yǎng)48 h后，取出并記錄種子的發(fā)芽率并測(cè)量各處理濃度下種子芽長(zhǎng)及根長(zhǎng)(芽長(zhǎng)：下胚軸基部至芽頂端的長(zhǎng)度；根長(zhǎng)：下胚軸基部至主根尖端的長(zhǎng)度)。

1.4.3 劑量-效應(yīng)曲線擬合 不同四環(huán)素類抗生素對(duì)白菜種子根和芽伸長(zhǎng)的抑制性的劑量-效應(yīng)關(guān)系曲線借鑒Logistic分布模型，將模型轉(zhuǎn)化為對(duì)數(shù)進(jìn)行擬合：

y=aln(x)+b。

式中：y為抑制長(zhǎng)度，cm；x為培養(yǎng)試液的有效濃度，mg/L；a、b為常數(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)算3次重復(fù)的平均值及標(biāo)準(zhǔn)偏差，繪制圖形，并用SPSS 17.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，差異顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 Ca2+ 單體溶液對(duì)白菜種子發(fā)芽率和根、芽伸長(zhǎng)的影響

不同濃度Ca2+中白菜種子發(fā)芽率在71.67%～88.33%(表1)，方差分析發(fā)現(xiàn)，Ca2+濃度對(duì)白菜種子發(fā)芽率有極顯著影響(P<0.01)，對(duì)芽伸長(zhǎng)和根伸長(zhǎng)具有顯著影響(P<0.05，圖1)。

表1 不同濃度Ca2+溶液處理下白菜種子的發(fā)芽率

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。同列數(shù)據(jù)后標(biāo)有不同大寫、小寫字母分別表示在0.01、0.05水平上差異顯著。

由圖1可知，白菜種子發(fā)芽后根系長(zhǎng)度隨著Ca2+濃度增加呈先增大后逐漸減小的趨勢(shì)。與CK(0 mol/L)相比，5×10-5mol/L 濃度條件促進(jìn)根系增長(zhǎng)，可能是由于Ca2+與細(xì)胞液進(jìn)行物質(zhì)交換，激活了細(xì)胞[10]。隨著Ca2+濃度的增加，根系長(zhǎng)度相比于CK均出現(xiàn)抑制現(xiàn)象，且1.0×10-2mol/L濃度條件下根系長(zhǎng)度約是CK的1/3，抑制了根的伸長(zhǎng)。Ca2+濃度對(duì)芽生長(zhǎng)影響較小，相比于CK，5×10-5～2.0×10-4mol/L CaCl2溶液處理的芽均有明顯伸長(zhǎng)，但1.0×10-3～1.0×10-2mol/L CaCl2對(duì)芽伸長(zhǎng)無明顯影響。根伸長(zhǎng)對(duì)Ca2+比芽伸長(zhǎng)更為敏感。

2.2 3種四環(huán)素類抗生素單體溶液對(duì)白菜種子發(fā)芽率及根和芽伸長(zhǎng)的影響

不同濃度梯度下，3種四環(huán)素類抗生素單體處理下白菜種子發(fā)芽率在61.67%～88.33%，結(jié)果見表2。方差分析發(fā)現(xiàn)，四環(huán)素和土霉素對(duì)白菜的發(fā)芽率有顯著影響，金霉素對(duì)白菜種子發(fā)芽率的影響達(dá)極顯著水平。

從圖2可知，金霉素、土霉素、四環(huán)素對(duì)白菜根伸長(zhǎng)表現(xiàn)為明顯的抑制作用，且低濃度抗生素溶液對(duì)白菜根伸長(zhǎng)的抑制強(qiáng)于高濃度。在低濃度抗生素處理下(0～5.0 mg/L)，隨著濃度的提高，根伸長(zhǎng)抑制趨勢(shì)越明顯。而在抗生素濃度>5.0 mg/L時(shí)，根伸長(zhǎng)抑制作用隨濃度的提高有所降低。低濃度時(shí)，3種四環(huán)素類抗生素對(duì)根伸長(zhǎng)的抑制作用有明顯差異，白菜根伸長(zhǎng)對(duì)金霉素最為敏感，與空白對(duì)照相比，金霉素濃度增至1.0 mg/L，白菜根伸長(zhǎng)從1.81 cm縮短至0.93 cm，縮短近50%。而土霉素濃度達(dá)到5.0 mg/L時(shí)，才對(duì)白菜根伸長(zhǎng)的抑制最為明顯。 高濃度時(shí)，3種四環(huán)素類抗生素對(duì)根伸長(zhǎng)抑制作用無明顯差異。

3種四環(huán)素類抗生素對(duì)白菜芽伸長(zhǎng)抑制作用較小。在0～2.0 mg/L濃度范圍內(nèi)，四環(huán)素和土霉素對(duì)芽生長(zhǎng)均具有一定的促進(jìn)作用，其中土霉素的作用效果高于四環(huán)素。當(dāng)濃度高于2.0 mg/L時(shí)，3種抗生素對(duì)芽伸長(zhǎng)的影響開始出現(xiàn)差異，四環(huán)素濃度增至 10.0 mg/L 時(shí)，對(duì)芽長(zhǎng)的抑制作用最為明顯，土霉素濃度高于 2.0 mg/L 時(shí)，白菜芽生長(zhǎng)隨濃度的增加一直在減少；但金霉素對(duì)芽伸長(zhǎng)在低濃度時(shí)稍有抑制作用，在5.0 mg/L時(shí)抑制效果最大，之后大約保持該抑制性。

表2 抗生素單體溶液對(duì)白菜種子發(fā)芽率的影響

注：同行數(shù)據(jù)后標(biāo)有不同大寫、小寫字母分別表示差異極顯著(P<0.01)、顯著(P<0.05)。表3同。

2.3 CaCl2 溶液配制的抗生素溶液對(duì)白菜種子發(fā)芽率及根和芽伸長(zhǎng)的影響

含0.01 mol/L Ca2+的抗生素各濃度處理結(jié)果表明，四環(huán)素和土霉素對(duì)白菜種子發(fā)芽有顯著影響，金霉素對(duì)白菜種子發(fā)芽無顯著影響。其發(fā)芽率在60.00%～81.67%(表3)，略低于只含抗生素單體的溶液。與0.01 mol/L CaCl2溶液相比，各濃度抗生素處理的白菜種子根長(zhǎng)和芽長(zhǎng)明顯降低(圖3)。Ca2+和抗生素共存時(shí)，抗生素濃度由0增至5.0 mg/L，根長(zhǎng)大幅度減小，當(dāng)濃度大于5.0 mg/L，根長(zhǎng)變化不明顯。3種抗生素在5.0 mg/L的同濃度處理下，根長(zhǎng)相差不大，與只含抗生素單體溶液的結(jié)果相似。0～5.0 mg/L濃度范圍內(nèi)，3種抗生素與CaCl2復(fù)合溶液對(duì)根伸長(zhǎng)的影響順序?yàn)榻鹈顾?四環(huán)素>土霉素。當(dāng)濃度低于2.0 mg/L時(shí)，四環(huán)素處理下芽生長(zhǎng)呈明顯的下降趨勢(shì)；而土霉素和金霉素處理的芽長(zhǎng)在0～1.0 mg/L 范圍內(nèi)大幅度下降，在1.0～2.0 mg/L濃度下呈微增長(zhǎng)趨勢(shì)，但依舊低于不含抗生素處理(0 mg/L)的芽長(zhǎng)。

表3 CaCl2和抗生素復(fù)合溶液處理對(duì)白菜種子發(fā)芽率的影響

2.4 含Ca2+的抗生素復(fù)合溶液和只含抗生素單體溶液處理的比較分析

0.01 mol/L CaCl2溶液配制的抗生素各處理濃度對(duì)根和芽伸長(zhǎng)的抑制大于用去離子水配制的抗生素各標(biāo)液，方差分析表明，2種配制方法中3種抗生素均出現(xiàn)處理間的顯著差異(P<0.05)，且各濃度處理下，只含抗生素單體溶液處理的種子根和芽的長(zhǎng)度約是含Ca2+和抗生素復(fù)合溶液處理的2倍。因此，Ca2+和3種四環(huán)素類抗生素的復(fù)合溶液對(duì)白菜根和芽伸長(zhǎng)抑制明顯大于只含抗生素單體溶液。另外，解吸液試驗(yàn)結(jié)果顯示，除不含土壤的空白對(duì)照組種子發(fā)芽[發(fā)芽率在(50±5)%]外，其余試驗(yàn)組種子均未發(fā)芽。一方面是白菜種子對(duì)污染物極為敏感，另一方面可能是供試土壤中大量陽(yáng)離子(9.13 cmol/kg)和金屬離子隨著解吸過程進(jìn)入解吸溶液，并與抗生素形成毒性更大的螯合物[11-12]。

2.5 Ca2+和3種四環(huán)素類抗生素單體溶液及其復(fù)合溶液對(duì)白菜種子根長(zhǎng)和芽長(zhǎng)的生態(tài)毒理效應(yīng)

植物的半抑制濃度常用于評(píng)價(jià)污染物的毒性強(qiáng)弱。由表4可見，水溶液中含Ca2+和抗生素對(duì)白菜根長(zhǎng)和芽長(zhǎng)抑制作用最強(qiáng)，根長(zhǎng)IC50均小于0.1 mg/L，芽長(zhǎng)IC50小于12 mg/L，說明白菜種子的根長(zhǎng)是含Ca2+和抗生素類有機(jī)污染生態(tài)毒理學(xué)的敏感生態(tài)學(xué)指標(biāo)[13]，且對(duì)根長(zhǎng)和芽長(zhǎng)的毒性大小為Ca2+和抗生素的復(fù)合溶液>3種抗生素單體溶液>Ca2+溶液，并且根長(zhǎng)>芽長(zhǎng)。這可能是由于植物對(duì)抗生素的吸收大部分在根部[14]，只有少部分轉(zhuǎn)移到其他部分并積蓄[15]。而且金屬離子與有機(jī)污染的復(fù)合毒性大于單一污染物的毒性。從而使白菜種子在較低含量的復(fù)合污染脅迫下，根部首先受到影響被抑制時(shí)，芽吸收種子自身養(yǎng)分而不被抑制。當(dāng)然，隨著抗生素和Ca2+的單體及復(fù)合溶液濃度增加，污染物會(huì)被根部吸收，甚至通過胚進(jìn)而影響芽伸長(zhǎng)和植株的生長(zhǎng)[16]。這與林琳等的研究結(jié)果[8，15，17]相似。在同等條件下，Ca2+和抗生素的復(fù)合溶液對(duì)白菜種子根長(zhǎng)和芽長(zhǎng)抑制效應(yīng)最大，其次是3種四環(huán)素類抗生素的單體，Ca2+的抑制效應(yīng)最小，且均為根長(zhǎng)的抑制效應(yīng)大于芽長(zhǎng)。

表4 Ca2+和3種四環(huán)素類抗生素的單體及復(fù)合溶液對(duì)白菜種子根長(zhǎng)和芽長(zhǎng)的半抑制濃度

3 結(jié)論

Ca2+對(duì)白菜種子萌發(fā)有顯著影響，且對(duì)白菜種子根伸長(zhǎng)有明顯的抑制性，但對(duì)芽伸長(zhǎng)的影響不明顯。金霉素單體溶液對(duì)白菜種子萌發(fā)有極顯著影響，其次為四環(huán)素和土霉素。Ca2+和四環(huán)素的復(fù)合溶液、Ca2+和土霉素的復(fù)合溶液對(duì)白菜種子發(fā)芽率有顯著影響，而Ca2+和金霉素的復(fù)合溶液無顯著影響。

在本試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，3種四環(huán)素類抗生素單體對(duì)白菜根伸長(zhǎng)具有明顯的抑制趨勢(shì)。當(dāng)濃度低于5.0 mg/L時(shí)，對(duì)根伸長(zhǎng)抑制效應(yīng)大小排序?yàn)榻鹈顾?四環(huán)素>土霉素；當(dāng)?shù)陀?2.0 mg/L 時(shí)，對(duì)芽伸長(zhǎng)有促進(jìn)作用，其中土霉素對(duì)芽長(zhǎng)的影響最大。

Ca2+和3種四環(huán)素類抗生素的復(fù)合溶液對(duì)白菜根和芽伸長(zhǎng)的抑制效應(yīng)明顯大于抗生素單體溶液。對(duì)根長(zhǎng)和芽長(zhǎng)的毒性大小排序?yàn)镃a2+和抗生素的復(fù)合溶液>3種抗生素單體溶液> Ca2+溶液，并且對(duì)根長(zhǎng)的影響大于芽長(zhǎng)。