劉勝亮， 朱舒亮， 楊 越， 李 靜， 李建貴

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)林業(yè)研究所，新疆烏魯木齊 830052；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)新疆紅棗工程技術(shù)研究中心，新疆烏魯木齊 830052

植物根際促生細(xì)菌(plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR)是能夠在植物根際土壤中定殖，并能夠促進(jìn)植物生長(zhǎng)、提高植物抗性或促進(jìn)土壤養(yǎng)分循環(huán)的有益微生物[1-2]。有研究表明，植物根際促生菌可以促進(jìn)土壤有機(jī)質(zhì)分解、加速土壤養(yǎng)分循環(huán)、提高植物對(duì)土壤養(yǎng)分的利用效率，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)意義重大[3-4]。何志剛等研究PGPR菌肥對(duì)馬鈴薯產(chǎn)量與肥料利用率影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，增施促生菌肥能夠明顯提高馬鈴薯地下塊莖對(duì)鉀、氮、磷的吸收，能夠明顯促進(jìn)馬鈴薯產(chǎn)量的提高[5]；燕紅等研究發(fā)現(xiàn)，微生物菌株可以明顯促進(jìn)鉀、磷的溶解[6]；吳興興等研究發(fā)現(xiàn)，PGPR能夠促進(jìn)蠶豆植株的生長(zhǎng)，并能明顯提高蠶豆的莢果數(shù)[7]。

對(duì)解磷微生物的研究最早開(kāi)始于20世紀(jì)30年代，前蘇聯(lián)科學(xué)家從土壤中分離得到1種溶磷能力較強(qiáng)的巨大芽孢桿菌[8]。20世紀(jì)50年代，科研人員從小麥根際土壤中分離得到溶解磷酸鈣能力較強(qiáng)的微生物[9]。目前，對(duì)解磷微生物進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，微生物在解磷時(shí)一般是通過(guò)分泌有機(jī)酸來(lái)實(shí)現(xiàn)的，有機(jī)酸可以通過(guò)螯合作用與Fe3+、Al3+、Ca2+等結(jié)合，從而達(dá)到溶解磷酸鹽的效果。王同等研究發(fā)現(xiàn)，紅壤溶磷菌B1主要通過(guò)分泌有機(jī)酸來(lái)溶磷[10]；石在強(qiáng)等研究解鹽促生菌Rs-5時(shí)發(fā)現(xiàn)，Rs-5菌株在溶磷過(guò)程中，檸檬酸、蘋(píng)果酸起主要作用[11]。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)大田紅棗施入解磷能力較強(qiáng)的4種菌株P(guān)7、P13、P15、P18，對(duì)不同解磷菌進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀測(cè)，研究解磷菌對(duì)紅棗根際土壤有機(jī)酸、速效磷含量的影響，為解磷菌在田間的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)在新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)林業(yè)研究所博湖南山實(shí)驗(yàn)基地的紅棗園進(jìn)行，該基地位于新疆巴音郭楞蒙古自治州博斯騰湖景區(qū)，86°40′～87°25′ E、41°56′～42°14′N，干燥少雨，溫差及蒸發(fā)量相對(duì)大，屬典型的大陸性荒漠氣候。

1.2 試驗(yàn)材料

選擇樹(shù)齡相同、株形和產(chǎn)量相對(duì)一致的6年生灰棗作為試驗(yàn)材料。供試解磷細(xì)菌P7(Bacillussp.)、P13(Acinetobactersp.)、P15(Acinetobactersp.)、P18(Enternhactersp.)由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)林業(yè)研究所微生物實(shí)驗(yàn)室提供，采用高溫滅菌處理的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，配方為：牛肉膏3.0 g、蛋白胨10.0 g、NaCl 5.0 g、瓊脂18.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 值為7.0～7.2。

1.3 試驗(yàn)處理

1.3.1 菌株擴(kuò)繁 無(wú)菌環(huán)境中，將經(jīng)過(guò)分離鑒定、解磷能力較強(qiáng)的菌株P(guān)7、P13、P15、P18進(jìn)行復(fù)蘇活化，無(wú)抗平板上劃線，溫育24 h；超凈工作臺(tái)上挑選典型單菌落進(jìn)行擴(kuò)繁。

1.3.2 田間試驗(yàn) 2016年4月25日，將4種單菌株進(jìn)行甲哌利福霉素(利福平)標(biāo)記，得到耐利福平的突變菌種；將突變菌株分別進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)合使用基肥，將培養(yǎng)菌株施入到紅棗根際，同時(shí)在施用基肥的基礎(chǔ)上以分別施入菌劑培養(yǎng)基、清水為對(duì)照，共計(jì)6個(gè)處理(處理1：菌劑P7+基肥；處理2：菌劑P13+基肥；處理3：菌劑P15+基肥；處理4：菌劑P18+基肥；處理5：菌劑培養(yǎng)基+基肥；處理6：清水+基肥)，接種后1、15、30、45、60、90、120 d對(duì)其進(jìn)行動(dòng)態(tài)回收觀測(cè)?；适┯昧繛?0 kg/株，試驗(yàn)組菌劑用量為原菌劑200 mL稀釋5倍，每株施用1 000 mL稀釋液；菌劑培養(yǎng)基對(duì)照用量為原菌劑培養(yǎng)基200 mL稀釋5倍，每株施用1 000 mL稀釋液；清水對(duì)照每株施用1 000 mL清水。采用穴施法施入，在棗樹(shù)正東方向距離紅棗樹(shù)10 cm位置挖1個(gè)長(zhǎng)、寬、深分別為50、30、30 cm的施肥坑。每小區(qū)4株，重復(fù)3次，隨機(jī)排列，單灌單排。

1.3.3 土壤樣品的采集 分別在處理前(0 d)、接種處理后1、30、60、90、120 d，在原施肥坑采集土壤樣品200～300 g/株，將同一小區(qū)4株樹(shù)的土壤樣品充分混勻，按照四分法分2次取檢測(cè)土樣200～300 g。

1.4 測(cè)定內(nèi)容與方法

1.4.1 土壤活菌數(shù) 無(wú)菌環(huán)境下取根際鮮土壤10 g，置于裝有90 mL無(wú)菌水的三角瓶中，28 ℃恒溫振蕩30 min，使微生物細(xì)胞充分分散，即得到10-1稀釋液；取0.5 mL稀釋液與4.5 mL無(wú)菌水混勻，依次稀釋得到10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10的稀釋液；將一系列稀釋液涂布在含有300 μg/mL利福平和300 μg/mL卡那霉素的牛肉膏蛋白胨平板上，28 ℃培養(yǎng)2 d，進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.4.2 土壤速效磷和有機(jī)酸含量 速效磷含量采用鉬藍(lán)比色法測(cè)定；土壤pH值采用酸度計(jì)法測(cè)定；有機(jī)酸含量采用高效液相色譜法測(cè)定[12-13]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0、Excel 2003軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同解磷菌處理對(duì)土壤活菌數(shù)的影響

由表1可知，菌株P(guān)13、P15、P18施入的菌落數(shù)約在 108CFU/g，而菌株P(guān)7的菌落數(shù)相對(duì)較多，達(dá)到109CFU/g；接種后15 d，各菌株存活的菌落數(shù)有明顯下降，在4.44×107～5.98×107CFU/g之間，存活率為接種后1 d時(shí)的5%～10%；接種后30 d，各菌株的菌落數(shù)仍然有明顯下降，在1.18×107～2.31×107CFU/g之間，菌株P(guān)7的活菌數(shù)相對(duì)較多，達(dá)到2.31×107CFU/g；接種后45～120 d，各菌株菌落數(shù)變化不大，基本穩(wěn)定在107CFU/g左右。由此可見(jiàn)，4種解磷菌株在接種后30 d時(shí)開(kāi)始適應(yīng)土壤環(huán)境，并形成定殖能力。

表1 菌株接種后不同時(shí)期紅棗根際土壤的菌落數(shù)

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫(xiě)字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。表2至表4同。

2.2 不同解磷菌處理對(duì)土壤pH值的影響

由圖1可知，與施菌前相比，接種后1 d各處理的pH值都有明顯下降，可能是由于施加菌液和水的原因?qū)е?；接種后30 d時(shí)pH值與接種后1 d相比有明顯上升，但仍低于未接種的時(shí)候；接種后30～120 d，各處理土壤的pH值呈逐漸降低趨勢(shì)，施加菌株的4個(gè)處理其pH值明顯低于對(duì)照僅接種菌劑培養(yǎng)基或清水。

2.3 不同解磷菌處理對(duì)土壤速效磷含量的影響

由圖2可知，接種后1 d，接種菌株及菌劑培養(yǎng)基的紅棗根際土壤速效磷含量較接種前有明顯上升；與接種后1 d相比，接種后30 d接種菌株P(guān)13、菌劑培養(yǎng)基的紅棗根際土壤速效磷含量有所下降，其他處理均有所上升，其中接種菌株P(guān)15的土壤速效磷含量增加幅度相對(duì)最大，達(dá)59.76%；接種后 60 d，各處理土壤的速效磷含量均超過(guò)30 mg/kg，但與接種后30 d相比多呈下降趨勢(shì)；接種后90 d，接種菌株P(guān)13、P15、P18的土壤速效磷含量較接種后60 d有明顯增長(zhǎng)；接種后120 d，接種菌株P(guān)13、P15、P18的土壤速效磷含量有較明顯的增加，其中以接種菌株P(guān)15優(yōu)勢(shì)最為明顯，而接種菌株P(guān)7及對(duì)照的土壤速效磷含量增長(zhǎng)幅度相對(duì)較??；與對(duì)照僅接種菌劑培養(yǎng)基或清水相比，接種菌株P(guān)7的土壤速效磷含量增加沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢(shì)，接種菌株P(guān)13的土壤速效磷含量在接種90 d后增加優(yōu)勢(shì)明顯，接種菌株P(guān)15的土壤速效磷含量在接種 30 d 后增加優(yōu)勢(shì)明顯，而接種菌株P(guān)18的處理，其土壤速效磷含量從一接種開(kāi)始整體呈增加趨勢(shì)，接種后120 d時(shí)增幅相對(duì)最大。因此，接種菌株P(guān)15、P18的處理解磷效果相對(duì)最好，可提高土壤速效磷的含量。

2.4 不同解磷菌處理對(duì)土壤有機(jī)酸含量的影響

2.4.1 丙酮酸 由表2可見(jiàn)，接種前及接種后1 d各處理土壤均未檢測(cè)到丙酮酸；接種后30 d，各處理土壤均檢測(cè)到丙酮酸，且這一時(shí)期丙酮酸含量相對(duì)較高，其中，接種菌株P(guān)13、P18的紅棗根際土壤丙酮酸含量超過(guò)1.9 mg/kg；接種后 60 d，除接種菌株P(guān)15的根際土壤丙酮酸含量有小幅上升外，其他處理的丙酮酸出現(xiàn)不同程度的下降，其中接種菌株P(guān)7的土壤丙酮酸含量下降最為明顯，而僅接種菌劑培養(yǎng)基、清水的對(duì)照處理未檢測(cè)到丙酮酸；接種后90 d，接種菌株P(guān)13、P15、P18的根際土壤丙酮酸含量有明顯下降，而其他處理較接種后60 d有所上升；接種后120 d，接種菌株P(guān)13、P15和清水的根際土壤丙酮酸含量較接種后90 d略有增加，其他處理則有小幅下降；整體來(lái)看，與對(duì)照相比，施加解磷菌的土壤其丙酮酸含量有明顯提高。

表2 不同解磷菌處理對(duì)紅棗根際土壤丙酮酸含量的影響

2.4.2 乳酸 由表3可見(jiàn)，接種后1 d與接種前相比，除接種清水的紅棗根際土壤乳酸含量未發(fā)生變化外，其他處理乳酸含量均有明顯增加；接種后30 d，各處理根際土壤乳酸含量均有不同程度增加，其中接種解磷菌的土壤乳酸含量增加較為明顯，接種菌株P(guān)13的土壤乳酸含量相對(duì)最高，達(dá)12.398 mg/kg；接種后60 d，紅棗根際乳酸含量出現(xiàn)明顯下降，接種菌株P(guān)15、P18及菌劑培養(yǎng)基、清水的土壤未檢測(cè)到乳酸存在；接種后90 d，除接種清水的土壤未檢測(cè)到乳酸外，其他各處理均檢測(cè)到乳酸存在，其中接種菌株P(guān)7、菌劑培養(yǎng)基的土壤乳酸含量相對(duì)較高，在5 mg/kg以上；接種后120 d，菌株P(guān)7、P18及菌劑培養(yǎng)基的土壤乳酸含量有所下降外，其他處理乳酸含量有不同程度的增加，其中接種菌株P(guān)13的土壤乳酸含量增加較為明顯；整體來(lái)看，與接種清水相比，接種菌株可明顯提高土壤的乳酸含量。

表3 不同解磷菌處理對(duì)紅棗根際土壤乳酸含量的影響

2.4.3 乙酸 由表4可見(jiàn)，接種前各處理土壤均未檢測(cè)到乙酸存在；接種后1 d，除接種菌株P(guān)7、P15的土壤檢測(cè)到少量乙酸外，其他處理土壤均未檢測(cè)到乙酸存在；接種后30 d，各處理土壤的乙酸含量有明顯增加，其中接種菌株P(guān)15的土壤乙酸含量增加最為明顯，達(dá)到1.552 mg/kg；接種后60 d，對(duì)照處理的土壤乙酸含量較接種后30 d有所下降，而接種解磷菌株的4個(gè)處理其土壤乙酸含量保持相對(duì)穩(wěn)定或有明顯增加；接種后90 d，接種菌株P(guān)7的紅棗根際土壤乙酸含量有明顯增加，乙酸含量相對(duì)最高，為11.025 mg/kg，而接種菌株P(guān)15、P18及清水的土壤未檢測(cè)到乙酸存在；接種后120 d，接種菌株P(guān)7的土壤乙酸含量相對(duì)較高，為0.966 mg/kg，對(duì)照處理的土壤乙酸含量明顯低于接種解磷菌株的。

2.5 速效磷含量與土壤有機(jī)酸含量的相關(guān)性分析

統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，紅棗根際土壤丙酮酸、乳酸、乙酸3種有機(jī)酸含量與土壤速效磷含量的相關(guān)系數(shù)分別為0.338、0.318、0.061，均呈正相關(guān)，其中，丙酮酸含量與土壤速效磷含量呈顯著性相關(guān)(P<0.05)。

表4 不同解磷菌處理對(duì)紅棗根際土壤乙酸含量的影響

3 結(jié)論與討論

土壤低分子量有機(jī)酸的產(chǎn)生與土壤微生物數(shù)量和活性密切相關(guān)[14]，土壤微生物的生理活動(dòng)能夠合成有機(jī)酸，其次生代謝產(chǎn)物影響著植物根系的有機(jī)酸含量[15]。本試驗(yàn)在紅棗根際土壤施加4種解磷菌，在紅棗根際土壤中形成良好的定殖能力，對(duì)紅棗根際土壤有機(jī)酸的產(chǎn)生有一定影響，與接種菌劑培養(yǎng)基、清水相比，接種菌株的紅棗根際土壤速效磷和丙酮酸、乙酸、乳酸等有機(jī)酸含量有不同程度增加，這與王同等的研究結(jié)論[10]相吻合。試驗(yàn)結(jié)果表明，接種菌株P(guān)15、P18的溶磷效果相對(duì)較好，接種菌株P(guān)7有利于提高土壤乙酸含量，接種菌株P(guān)13有利于土壤丙酮酸和乳酸的提升，這說(shuō)明微生物溶磷過(guò)程中有機(jī)酸是一種重要因子，但不是唯一因素[16]，這可能與不同種類有機(jī)酸所含功能基數(shù)目及螯合能力不同有關(guān)，從而具有不同的活化能力[17]。

另外，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，紅棗根際土壤丙酮酸、乳酸、乙酸3種有機(jī)酸含量與土壤速效磷含量均呈正相關(guān)，說(shuō)明這3種有機(jī)酸可促進(jìn)土壤速效磷含量的提升，但相關(guān)系數(shù)相對(duì)較小，究竟是何因子起關(guān)鍵作用還需要作進(jìn)一步的研究探討。