李 軍， 郝彩琴， 張 燃， 冷曉紅

(寧夏職業(yè)技術(shù)學(xué)院，寧夏銀川 750021

銀柴胡(別稱銀胡、山菜根、牛肚根、沙參兒、白根子等)是石竹科繁縷屬植物銀柴胡(StellariadichotomaL. var.lanceolateBge.) 的干燥根[1]，味甘性寒，具有清虛熱、除疳熱的功效，臨床用于陰虛發(fā)熱、骨蒸勞熱、小兒疳熱等癥[2]。銀柴胡作為2015年版《中華人民共和國藥典》收載的傳統(tǒng)中藥[3]，在臨床上的應(yīng)用比較廣泛，尤其是將其作為主要成分的傳統(tǒng)中成藥烏雞白鳳丸，在臨床上有很好的口啤[4]。

DNA條形碼技術(shù)(DNA bar-coding)作為中藥材物種鑒定研究中的新方法，是利用標準的、有足夠變異的、易擴增且相對較短的DNA片段對物種進行快速、準確的鑒定的技術(shù)[5]，且具有鑒定結(jié)果準確、可重復(fù)性良好、方法通用性強等優(yōu)點。DNA條形碼鑒定技術(shù)已經(jīng)在冬蟲夏草、枸杞、羌活、黨參、天南星、鎖陽等中藥材及其混偽品的鑒定中取得了良好的效果[6]，并已被收錄進2015年版《中華人民共和國藥典》[3]。獲取高質(zhì)量的DNA是進行銀柴胡DNA條形碼研究的必要前提和關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本研究以銀柴胡葉片、鮮根和干根為材料，考察6種DNA提取方法，旨在尋找一種能夠得到相對高產(chǎn)量、高純度的適合于銀柴胡總DNA提取的方法[7-8]，為后續(xù)銀柴胡DNA條形碼分子鑒定及分子生物學(xué)的深入研究提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

銀柴胡葉片和鮮根于2016年10月采自寧夏回族自治區(qū)吳忠市同心縣預(yù)旺鎮(zhèn)南關(guān)村，葉片和一部分根趁鮮放入 -70 ℃ 冰箱中冷凍，備用，另一部分根自然晾干。以上樣品經(jīng)寧夏大學(xué)李吉寧教授鑒定為石竹科繁縷屬植物銀柴胡(StellariadichotomaL. var.lanceolateBge.)的葉片及根。

1.2 儀器與試劑

My Cycler PCR儀、Bio Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)、Powerpac basic瓊脂糖凝膠電泳儀，購自美國伯樂有限公司；Sigma1-14高速離心機，購自德國Sigma公司；Geno 2010高通量組織研磨機，購自美國SPEX SamplePrep公司；Q6000核酸蛋白檢測儀，購自美國Quawell公司；TGL-16G型低溫冷凍離心機，購自上海安亭科學(xué)儀器廠；Mini10k迷你離心機，購自珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司；SZ-1渦旋混合器，購自常州國宇儀器制造有限公司；HHSY21-Ni4-C恒溫水浴鍋，購自北京長源實驗設(shè)備廠。

十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、聚乙烯吡咯烷酮 40(PVP-40，純度>95%)、三羥甲基氨基甲烷(Tris，純 度>99.5%)。植物基因組DNA提取試劑盒、PCR所用dNTPs(10 mmol/L)、TaqDNA聚合酶(5 U/μL)、Mg2+(25 mmol/L)、10×PCR buffer、DL 2000 marker，均購自天根生化科技(北京)有限公司；ITS2和psbA-trnH引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；瓊脂糖為西班牙瓊脂糖Biowest Agarose；三氯甲烷、異戊醇、乙醇、異丙醇、無水乙醇、氯化鈉、醋酸鈉等為國產(chǎn)分析純試劑。

1.3 DNA提取方法

以銀柴胡的葉片、鮮根和干根為材料，分別采用2% CTAB法、4% CTAB法、SDS法、試劑盒法、高鹽低pH值法和尿素法共6種方法提取3種材料的DNA。提取的DNA經(jīng)紫外檢測、瓊脂糖凝膠電泳和PCR擴增確定最適方法。

1.3.1 2%CTAB法 取銀柴胡葉片(長0.5～1.0 cm)、鮮根(長0.2～0.5 cm)和干根(長0.2～0.5 cm)，經(jīng)70%乙醇擦洗表面后放入600 μL 2% CTAB緩沖液[2% CTAB、100 mmol/L Tris-HCl(pH值8.0)、20 mmol/L EDTA、1.4 mol/L NaCl、2%可溶性PVP]中，并加入2%β-巰基乙醇，再加2枚直徑為 0.45 mm 的小鋼珠，葉片和鮮根置于研磨儀上，以1 400次/min研磨4 min，干根以1 600次/min研磨6 min； 65 ℃水浴30～45 min，4 ℃、12 000 r/min離心 10 min；在上清液中加入等體積三氯甲烷、異戊醇(體積比為24 ∶1) 充分混勻，4 ℃、12 000 r/min 離心10 min；取上清液，重復(fù)以上步驟1～2次，直到界面清晰為止；在上清液中加入2～3倍體積的-20 ℃預(yù)冷的異丙醇，于-20 ℃靜置30 min，4 ℃、12 000 r/min離心 20 min；沉淀用70%乙醇洗滌2次后，4 ℃、12 000 r/min離心 2 min，沉淀晾干后加入100 μL TE緩沖液[由三羥甲基氨基甲烷(Tris)和EDTA配制而成]溶解，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 4% CTAB法 具體步驟參考“1.3.1”節(jié)，提取液為4% CTAB緩沖液[2% CTAB、100 mmol/L Tris-HCl(pH值8.0)、20 mmol/L EDTA、1.4 mol/L NaCl、3%可溶性PVP、2%β-巰基乙醇]。

1.3.3 SDS法 具體步驟參考“1.3.1”節(jié)，提取液為SDS緩沖液[10% SDS、50 mmol/L Tris-HCl(pH值8.0)、100 mmol/L EDTA、1%可溶性PVP、2%β-巰基乙醇]。

1.3.4 試劑盒法 在材料中加入GP1緩沖液，參照 “1.3.1”節(jié)的方法研磨，采用植物基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)提取DNA，詳細操作參照試劑盒說明書。

1.3.5 高鹽低pH值法 根據(jù)文獻[9]的操作步驟進行試驗，材料處理方法同“1.3.1”節(jié)，提取緩沖液含0.1 mol/L NaAc、0.05 mol/L EDTA、0.5 mmol/L NaCl、3% PVP、3% SDS、1%β-巰基乙醇。

1.3.6 尿素法 在材料中加入尿素裂解液[7 mmol/L尿素、0.3 mol/L 氯化鈉、0.034 mol/L十二烷基肌氨酸鈉、50 mmol/L Tris-HCl(pH值8.0)、20 mmol/L EDTA(pH值 8.0)]，參照 “1.3.1”節(jié)的方法研磨，搖勻，65 ℃水浴20～30 min；12 000 r/min離心10 min，吸取上清液，將上清液移入另一新管中；加入等體積的三氯甲烷、異戊醇(體積比為 24 ∶1)溶液，振蕩數(shù)次混勻，12 000 r/min離心10 min；重復(fù)上述步驟；在上清液中加入2/3體積的-20 ℃預(yù)冷的異丙醇，混勻，-20 ℃沉淀 30 min，12 000 r/min離心10 min；在沉淀中加入200 μL 70%乙醇洗滌2次，4 ℃、12 000 r/min離心2 min，沉淀晾干后加入100 μL TE溶解，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 DNA的質(zhì)量檢測

1.4.1 紫外檢測 取2 μL采用6種方法提取的銀柴胡葉片、鮮根及干根DNA溶液，用核酸蛋白檢測儀分別測定260、280 nm處的吸光度。根據(jù)D260 nm/D280nm值判斷DNA純度，根據(jù)D260 nm計算DNA濃度。

1.4.2 瓊脂糖凝膠電泳檢測 取7 μL DNA母液加1 μL上樣緩沖液，用Gelred進行染色，上樣于1%瓊脂糖凝膠，以DL 2000 marker為標準，在1×TAE的電泳緩沖液中進行水平板電泳，100 V恒電壓，電泳約30 min，用凝膠成像系統(tǒng)進行拍照檢測。

1.4.3 PCR擴增檢測 以試劑盒法提取銀柴胡葉片和鮮根DNA、高鹽低pH值法提取干根所得DNA為模板，按照文獻[9]中ITS2和psbA-trnH通用引物、25 μL反應(yīng)體系和條件進行PCR擴增。擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，用Bio Gel DocTM XR+凝膠成像分析系統(tǒng)拍照、分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取銀柴胡總DNA的紫外檢測

由表1可知，用試劑盒法、2% CTAB法、4% CTAB法提取得到的銀柴胡葉片DNA的D260nm/D280 nm值均在1.8～2.0范圍，表明這3種方法得到的DNA質(zhì)量較好。試劑盒法提取的DNA濃度較高，高鹽低pH值法提取的DNA濃度最低，且D260 nm/D280 nm值大于2.0，說明有酚類和糖類等的污染。SDS法與尿素法提取到的DNA的D260 nm/D280 nm值小于1.8，說明得到的DNA中存在蛋白質(zhì)的污染。

表1 銀柴胡藥材葉片總 DNA 提取純度及濃度

由表2可知，對于銀柴胡鮮根DNA的提取，2% CTAB法、4% CTAB法和試劑盒法提取DNA的D260 nm/D280 nm值均在1.8～2.0標準范圍內(nèi)，表明其DNA純度較高，其中試劑盒法提取的濃度最高；高鹽低pH值法提取DNA的D260 nm/D280 nm值在2.0以上，說明有多糖、酚類等雜質(zhì)污染。SDS法和尿素法提取的DNA濃度較高，其D260 nm/D280 nm值均低于1.8，說明有蛋白質(zhì)、有機物等雜質(zhì)污染。

表2 銀柴胡鮮根總DNA提取純度及濃度

由表3可知，對于干根DNA的提取，試劑盒法和高鹽低pH值法提取的DNA的D260 nm/D280 nm值均在1.8～2.0范圍，表明其DNA純度較高；2% CTAB法、4% CTAB法和SDS法提取的DNA濃度相對較高，其D260nm/D280nm值均在2.0以上或小于1.8，說明有雜質(zhì)污染。尿素法提取的DNA濃度最低，說明提取效果欠佳。

表3 銀柴胡干根總DNA提取純度及濃度

2.2 瓊脂糖凝膠電泳檢測

由圖1可知，試劑盒法所提銀柴胡葉片DNA完整性較好，電泳條帶單一；2%和4%CTAB法提取的DNA濃度較低，且稍有降解；SDS法和尿素法提取的DNA條帶清晰，濃度高，但有拖尾，降解較嚴重；高鹽低pH值法提取DNA泳道無條帶，電泳未檢出DNA。6種提取方法中，試劑盒法提取的DNA電泳條帶最整齊明亮，說明DNA完整，該結(jié)果與紫外檢測結(jié)果一致。因此，后續(xù)試驗可以選擇用試劑盒法提取銀柴胡葉片DNA，用于中藥條形碼序列ITS2的擴增。

由圖2可知，試劑盒法提取DNA條帶最亮，濃度最高，條帶完整，提取效果最好。4% CTAB法提取的DNA條帶單一，完整性好，但亮度不高，說明濃度低。其他3種方法提取的DNA都有降解，其中尿素法降解最嚴重，該結(jié)果與紫外檢測結(jié)果一致。因此，后續(xù)試驗可以選擇用試劑盒法提取銀柴胡鮮根DNA，用于中藥條形碼序列的擴增。

由圖3可知，試劑盒法和高鹽低pH值法提取干根的條帶單一，降解較少，質(zhì)量好，濃度高。未檢測到尿素法提取的DNA，其他3種方法的DNA降解都較多。該結(jié)果與紫外檢測結(jié)果一致。其中試劑盒法成本相對較高，故后續(xù)試驗可以選擇高鹽低pH值法提取銀柴胡干根的DNA，用于中藥條形碼序列的擴增。

2.3 PCR擴增檢測

由圖4可知，銀柴胡葉片、鮮根和干根均可擴增出清晰的DNA條帶，表明用對應(yīng)方法提取銀柴胡DNA的質(zhì)量完全能夠滿足后續(xù)ITS2和psbA-trnH序列的PCR擴增反應(yīng)要求。

3 討論與結(jié)論

DNA條形碼研究包括DNA提取、PCR擴增、DNA測序以及基于條形碼數(shù)據(jù)庫的序列比對等工作，獲得高質(zhì)量的基因組DNA，是進行DNA條形碼研究的前提。目前，提取植物基因組DNA的方法有很多，如CTAB法、SDS法、高鹽低pH值法、尿素法、試劑盒法等[10]。CTAB法能有效除去材料中的蛋白質(zhì)、多糖和酚類等物質(zhì)，但由于步驟多、試劑組成復(fù)雜、易污染等缺點，在使用上受到了一定的限制；SDS法操作簡單、溫和，但對于次生代謝物、多糖等含量較高的植物，提取出的基因組DNA質(zhì)量往往不高；高鹽低pH值法操作方便省時，所需樣品量少，適用于瀕危植物或干燥藥材DNA的提取[11-12]；試劑盒法提取基因組DNA因其操作簡單、快速，得到的總DNA純度高，近年來已被廣泛采用；尿素法操作溫和、簡單、快速，但其DNA質(zhì)量不高[13]。本研究選擇6種常用的DNA提取方法，篩選出提取銀柴胡葉片、鮮根和干根的最適方法，其中試劑盒法提取3種材料的DNA質(zhì)量和濃度都較好，因后續(xù)試驗中樣品處理量較大，且費用有限，考慮到提取成本，銀柴胡葉片和鮮根采用試劑盒法提取DNA，而干根采用高鹽低pH值法提取DNA。在用試劑盒提取時也應(yīng)注意：在漂洗吸附柱時，加入漂洗液后可靜置1 min后再進行離心，從而提高DNA的質(zhì)量；加入TE緩沖液洗脫之前必須保證吸附材料徹底晾干，避免漂洗液中的乙醇等溶劑影響后續(xù)試驗。用高鹽低pH值法提取時，應(yīng)將干根提前放于-70 ℃冷凍過夜，可以提高材料脆性，易于粉碎；加入提取液研磨后于65 ℃水浴，時間不宜過長，60 min即可，太長會加快DNA的降解。

銀柴胡根中富含多糖、多酚、纖維和貯藏物質(zhì)等，極易氧化，且蛋白質(zhì)含量高，DNA提取溶液渾濁，產(chǎn)率較低，在研磨前加入PVP和β-巰基乙醇可防止多元酚類物質(zhì)氧化[14]。另外，樣品處理時組織研磨機的轉(zhuǎn)速和時間會影響細胞破碎的效果，故對其進行了優(yōu)化，既能使藥材研磨完全，又能降低DNA的損失，選出的干根最佳研磨條件為1 600次/min，研磨6 min，提高了DNA的質(zhì)量和產(chǎn)率。

從銀柴胡鮮根中提取的DNA濃度較干根高，但純度相對較低，原因可能是新鮮材料活性較高，DNA降解少，各種代謝產(chǎn)物和后含物含量高，在提取過程中不易去除干凈；干根由于晾干過程時間長、溫度高，造成DNA大量降解，因此得率低，完整性差。而葉片提取的DNA濃度低，可能與葉片比根取樣量相對少有關(guān)。另外，以優(yōu)選方法提取的銀柴胡葉片、鮮根和

干根總DNA能夠擴增出ITS2和psbA-trnHDNA條形碼序列。本研究根據(jù)不同方法對銀柴胡葉片、鮮根和干根DNA提取的檢測結(jié)果，比較得出相對適合的銀柴胡不同材料總DNA提取方法，為后續(xù)的DNA條形碼分子鑒定及分子生物學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。