陳文晶，王志剛，徐偉慧，劉澤平，呂智航，王春龍

(齊齊哈爾大學(xué) 生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

鄰苯二甲酸酯(phthalate esters， PAEs)被用作化學(xué)增塑劑[1]，在塑料制品中PAEs的含量高達80%[2]。2011年，中國PAEs消費量達到220萬t[3]。PAEs是半揮發(fā)性化合物[4]，通過相對較弱的化學(xué)鍵(氫鍵或范德華力)連接塑料。隨著塑料工業(yè)的發(fā)展和PAEs的廣泛使用，有關(guān)PAEs污染和健康風(fēng)險的報道越來越多，空氣、水、沉積物、土壤和食物中均有檢測到PAEs存在的報告[5-11]。PAEs是具有致畸、致癌、致突變作用，和內(nèi)分泌干擾性質(zhì)的化合物[12]，因此，美國國家環(huán)境保護局和中國環(huán)境監(jiān)測中心均將鄰苯二甲酸二甲酯(dimethyl phthalate， DMP)、鄰苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate， DBP)等PAEs列為優(yōu)先控制的污染物[13]。

東北黑土在確保國家糧食安全方面具有重要的作用[14]。原始黑土土質(zhì)肥沃，但近幾十年來，由于農(nóng)藥和化肥過度施用，以及薄膜覆蓋，PAEs持續(xù)進入土壤環(huán)境，造成了一系列農(nóng)業(yè)生態(tài)問題。土壤酶通常被認作是土壤質(zhì)量指標之一，也是微生物群體代謝狀態(tài)、土壤化學(xué)和物理條件的重要“傳感器”[15]。土壤脲酶、轉(zhuǎn)化酶在土壤養(yǎng)分與有機質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中起關(guān)鍵作用[16]，相比土壤其他物理化學(xué)指標，其對外源刺激更加敏感[17]，因此可以反映不同生態(tài)系統(tǒng)的土壤污染水平。

在東北黑土中，PAEs類污染物被廣泛檢出[18]，改變了黑土微生物群落與功能[19]，然而其對黑土酶促反應(yīng)動力學(xué)的影響尚不清晰。故采用非緩沖液法，以東北黑土為供試土壤，PAEs中側(cè)鏈較短和側(cè)鏈較長的DMP和DBP為代表，研究其對黑土中脲酶和轉(zhuǎn)化酶活性及酶促反應(yīng)動力學(xué)的影響，以期為環(huán)境保護和監(jiān)測提供理論基礎(chǔ)及技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

DMP和DBP(純度>99.5%)購自天津市光富精細化工研究所。

供試黑土采自黑龍江省克山農(nóng)場(125°39292′N，48°304171′E)，系未污染土樣。多點混合取樣法采集0～20 cm土樣，剔除石塊、草根等雜物后混勻，室溫風(fēng)干，過3 mm尼龍篩備用。供試土壤的理化性質(zhì)：總有機碳2.68%，陽離子交換量46.8 cmol·kg-1，土壤pH值6.3。

1.2 實驗設(shè)計與指標檢測

1.2.1 PAEs污染對土壤酶活的影響

向5 g土樣中添加5 mL不同濃度(0、5、10、20、40 mg·kg-1)的PAEs溶液，混勻維持30 min后，加入15 mL 8%蔗糖溶液、5 mL H2O、0.5 mL甲苯，搖勻，37 ℃培養(yǎng)。定期取樣，采用3，5-二硝基水楊酸法測定轉(zhuǎn)化酶活性[20]，以生成葡萄糖的量表示。具體地：加入3 mL 0.022 mol·L-13， 5-二硝基水楊酸，沸水浴加熱5 min，取出后冷水浴冷卻至室溫，540 nm波長處比色。每個處理重復(fù)3次，并設(shè)無底物、無土壤處理作為對照。

向5 g土樣中添加5 mL不同濃度(0、5、10、20、40 mg·kg-1)的PAEs溶液，混勻維持30 min后，加入10 mL 0.1 mol·L-1的尿素溶液、20 mL H2O、0.5 mL甲苯，搖勻，37 ℃培養(yǎng)。定期取樣，采用靛酚藍比色法測定脲酶活性[20]，以生成NH3-N的量表示。具體地：加入3 mL 0.012 mol·L-1次氯酸鈉和4 mL 0.27 mol·L-1苯酚鈉，顯色20 min后定容，578 nm波長處比色。每個處理重復(fù)3次，并設(shè)無底物、無土壤處理作為對照。

1.2.2 PAEs污染對土壤酶促反應(yīng)動力學(xué)的影響

向5 g土樣中添加5 mL不同濃度(0、5、10、20、40 mg·kg-1)的PAEs溶液，混勻維持30 min后，加入15 mL不同濃度(0.010、0.025、0.050、0.100 mo1·L-1)的蔗糖溶液、5 mL H2O、0.5 mL甲苯，37 ℃培養(yǎng)，定期取樣，測定轉(zhuǎn)化酶活性。

向5 g土樣中添加5 mL不同濃度(0、5、10、20、40 mg·kg-1)的PAEs溶液，混勻維持30 min后，加入10 mL不同濃度(0.010、0.025、0.050、0.100 mo1·L-1)的尿素溶液、20 mL H2O、0.5 mL甲苯，37 ℃培養(yǎng)，定期取樣，測定脲酶活性。

1.3 指標測定

1.3.1 定濃抑制率

定濃抑制率(I)的計算公式為

(1)

式(1)中：y為PAEs處理下的酶活性；yc為未經(jīng)PAEs處理的酶活性。

1.3.2 EDx值

根據(jù)土壤酶活性和PAEs濃度作線性回歸，由擬合方程計算生態(tài)劑量(ED10)，表示酶活性降低10%時的PAEs濃度，并將其作為表征土壤輕度污染的指標。

1.3.3 酶促反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)

酶催化活性(V)的特征由米氏方程描述：

(2)

式(2)中：米氏常數(shù)Km值通常表征酶與底物結(jié)合的牢固程度，μmol·L-1；最大反應(yīng)速度Vmax是總酶量的量度，可表征酶-底物復(fù)合物分解為酶和產(chǎn)物的速率，μmol·L-1·g-1·h-1[21]；s代表底物濃度，mol·L-1。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)在Excel上進行整理，在SPSS 22.0上進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PAEs污染對黑土中酶活性的影響

2.1.1 轉(zhuǎn)化酶

由表1可知，隨著PAEs濃度升高，轉(zhuǎn)化酶定濃抑制率增大，說明黑土中轉(zhuǎn)化酶活性受到PAEs持續(xù)增加的抑制作用。根據(jù)DMP、DBP對黑土中轉(zhuǎn)化酶活性的影響進行回歸分析，計算得出黑土中轉(zhuǎn)化酶的生態(tài)劑量ED10分別為24.352和16.911 mg·kg-1。

2.1.2 脲酶

由表2可知，隨著PAEs濃度升高，脲酶定濃抑制率增大，說明黑土中脲酶活性受到PAEs持續(xù)增加的抑制作用。根據(jù)DMP、DBP對黑土中脲酶活性的影響進行回歸分析，計算得出黑土中脲酶的生態(tài)劑量ED10分別為5.015和8.677 mg·kg-1。

2.2 PAEs污染對黑土中酶促反應(yīng)動力學(xué)的影響

2.2.1 轉(zhuǎn)化酶

表1不同濃度PAEs對黑土中轉(zhuǎn)化酶活性及定濃抑制率的影響

Table1Effect of different concentrations of PAEs on invertase activity and concentration inhibition rate in black soil

污染物濃度Pollutant concentration/(mg·kg-1)DMP酶活Enzyme activity/(μg·g-1·h-1)定濃抑制率Concentration inhibitionrate/%DBP酶活Enzyme activity/(μg·g-1·h-1)定濃抑制率Concentration inhibitionrate/%011943.030±0.018 a0 b11943.030±0.018 a0 b511912.727±0.019 b0.254 a9956.162±0.004 b16.636 a1011685.455±0.013 b2.157 a9211.212±0.018 b22.874 a2010617.273±0.012 b11.101 a8784.444±0.014 b26.447 a4010094.545±0.020 b15.478 a8562.222±0.005 b28.308 a

表中同列數(shù)據(jù)后無相同小寫字母的表示差異顯著(P<0.05)。下同。

Data followed by no same letters indicated significant difference atP<0.05. The same as below.

表2不同濃度PAEs對黑土中脲酶活性及定濃抑制率的影響

Table2Effect of different concentrations of PAEs on urease activity and concentration inhibition rate in black soil

污染物濃度Pollutant concentration/(mg·kg-1)DMP酶活Enzyme activity/(μg·g-1·h-1)定濃抑制率Concentration inhibitionrate/%DBP酶活Enzyme activity/(μg·g-1·h-1)定濃抑制率Concentration inhibitionrate/%0141.279±0.028 a0 b141.279±0.028 a0 b599.876±0.023 b29.306 a100.500±0.022 b28.864 a1060.436±0.013 b57.611 a82.186±0.007 b41.827 a2058.474±0.016 b58.611 a76.023±0.005 b46.189 a4011.446±0.010 b91.898 a66.721±0.006 b52.774 a

由表3可知，PAEs使黑土中轉(zhuǎn)化酶酶促反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)Vmax和Km降低，屬于反競爭抑制機制[22]，即PAEs刺激了轉(zhuǎn)化酶與底物的親和力，但是削弱了酶-底物復(fù)合物分解為酶和產(chǎn)物的速率。

2.2.2 脲酶

由表4可知，PAEs使黑土中脲酶酶促反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)Vmax和Km降低，屬于反競爭抑制機制，即PAEs刺激了脲酶與底物的親和力，但是削弱了酶-底物復(fù)合物分解為酶和產(chǎn)物的速率。

表3PAEs對黑土中轉(zhuǎn)化酶動力學(xué)參數(shù)的影響

Table3Effect of PAEs on invertase kinetic parameters in black soil

污染物濃度Pollutant concentration/(mg·kg-1)DMPKm/(μmol·L-1)Vmax/(μmol·L-1·g-1·h-1)DBPKm/(μmol·L-1)Vmax/(μmol·L-1·g-1·h-1)00.0217.2250.0217.22550.0145.6950.0236.609100.0115.1490.0175.787200.0135.2220.0165.565400.0124.9460.0145.071

表4PAEs對黑土中脲酶動力學(xué)參數(shù)的影響

Table4Effect of PAEs on urease kinetic parameters in black soil

污染物濃度Pollutant concentration/(mg·kg-1)DMPKm/(μmol·L-1)Vmax/(μmol·L-1·g-1·h-1)DBPKm/(μmol·L-1)Vmax/(μmol·L-1·g-1·h-1)00.1060.4560.1060.45650.0370.1330.0340.409100.0270.0540.0230.254200.0170.0400.0150.154400.0050.0180.0120.133

3 討論

研究顯示，黑土中DBP的殘留量為2.75～14.62 mg·kg-1[23]，不同季節(jié)黑土中PAEs的總體含量在1.37～4.90 mg·kg-1[18]。隨檢測方法、檢測時間，以及檢測位點不同，土壤環(huán)境中PAEs的殘留量檢測差異很大，因此，本實驗中PAEs的處理濃度設(shè)定為0、5、10、20、40 mg·kg-1。

土壤酶是土壤的重要生化部分，催化了土壤中眾多重要的生化反應(yīng)，在物質(zhì)轉(zhuǎn)化、能量代謝、污染土壤修復(fù)等過程中發(fā)揮著重要作用[24-25]。同時，土壤酶對土壤污染很敏感，可以作為環(huán)境污染的檢測指標[26]，如芳基硫酸酯酶活性可以表征土壤中阿魏酸的含量[27]，脲酶活性可表征土壤一氯苯污染程度[28]。在本研究中，DMP污染黑土中轉(zhuǎn)化酶和脲酶的ED10分別為24.352和5.015 mg·kg-1，DBP污染黑土中轉(zhuǎn)化酶和脲酶的ED10分別為16.911和8.677 mg·kg-1。根據(jù)ED10值越小越敏感的原則，判定黑土中脲酶對PAEs污染比較敏感，可將脲酶活性作為PAEs污染黑土的生化指標。

酶促反應(yīng)動力學(xué)是研究土壤酶促反應(yīng)機制的重要手段之一，經(jīng)典的穩(wěn)態(tài)動力學(xué)可用來描述土壤中催化反應(yīng)的進程，有助于了解土壤酶的作用機理[29]。研究顯示：隨著草甘膦濃度的增大，Vmax、Vmax/Km及K值增大，說明草甘膦的加入增加了轉(zhuǎn)化酶酶促反應(yīng)的初速度，進而激活了轉(zhuǎn)化酶的活性[20]。一氯苯對堿性磷酸酶的作用機制為非競爭性抑制[28]，鄰二氯苯對塿土轉(zhuǎn)化酶的作用機制以非競爭性抑制為主[29]。但本研究顯示， PAEs使黑土中轉(zhuǎn)化酶和脲酶酶促反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)Vmax和Km降低，屬于反競爭抑制機制，即PAEs刺激了脲酶和轉(zhuǎn)化酶與底物的親和力，但是削弱了酶-底物復(fù)合物分解為酶和產(chǎn)物的速率，從而抑制其酶活性。