阮馨怡，劉 曦，關 玥，孔海南，林 燕

(上海交通大學 環(huán)境科學與工程學院，上海 200240)

隨著我國城鎮(zhèn)化水平不斷提高，污水處理設施建設高速發(fā)展，截至2015年7月，我國城鎮(zhèn)污水日處理能力已達到1.70億 t[1]。一般情況下，污水處理廠每處理1萬t生活污水可產生污泥5～8 t，每處理1萬t工業(yè)污水可產生污泥10～30 t?？紤]到工業(yè)廢水和生活污水未來排放量變化，預計到2020年我國污泥產量為8 382萬t[2]。然而，我國污泥無害化處理率至今依然較低，大量污水廠仍采取直接傾倒或簡單填埋的手段處理污泥，未經處理的污泥不僅對生態(tài)環(huán)境構成嚴重威脅，而且大量占用有限的土地資源。厭氧消化可對大量集中的污泥進行處理，且在處理過程中能達到能量回收和降低環(huán)境危害的目的，日漸發(fā)展成為污泥穩(wěn)定化及資源化處置過程中廣泛應用的方法。

我國有250余萬個自然村，其污水排放量約占我國生活污水總排放量的55%。然而，村鎮(zhèn)污水來源分散、難于集中，只能通過建設小規(guī)模污水處理設施進行處理，但大量分散的污泥無法使用厭氧消化的方法進行集中處理?，F(xiàn)有的針對小規(guī)模污泥進行處理的方法有深度脫水工藝、加鈣干化工藝和好氧堆肥3種技術路線[3]，其中，深度脫水工藝和加鈣干化工藝都需要對現(xiàn)有污水處理廠進行改造，成本較高，相對而言，堆肥方法經濟、簡便，且能夠同時達到污泥處理資源化、無害化的目的，具有良好的發(fā)展前景。

高溫菌在高溫條件下降解酶活性高、代謝能力強，能縮短生物轉化的周期，提高有機質降解效率[4]，在污泥降解轉化生產有機肥領域具有巨大的經濟效益和潛能。本研究從采集的樣品中篩選能在高溫條件下有效降解污泥的菌株，按照一定比例相互混合，研制復合微生物菌劑，用于污泥的高溫堆肥處理，進行好氧堆肥試驗，并設置空白對照組，定期檢測堆體中溫度、pH、含水率、有機質含量和種子發(fā)芽指數(shù)等指標，旨在提高污泥的降解能力，并將其轉化為高質量的有機肥，為微生物菌劑在污泥堆肥中的應用提供一定的參考依據(jù)與菌種資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種來源

試驗所用菌種分別采自某地的高溫土壤(編號T1～T3)、污水處理廠的脫水污泥(編號W1～W5)、堆肥高溫期的物料(編號G1、G2)和經過65 ℃好氧堆肥后的腐熟物料(編號F1、F2)。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨 10 g·L-1，酵母提取物 5 g·L-1，氯化鈉 10 g·L-1，121 ℃滅菌20 min。

分離培養(yǎng)基：脫水污泥(含水率83%)100 g·L-1，瓊脂18 g·L-1，121 ℃滅菌20 min。

1.1.3 堆肥原料

堆肥原料為某污水處理廠脫水污泥和鋸末，具體性質見表1。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株分離、純化

取20 g菌源樣品于盛有100 mL無菌水的250 mL錐形瓶中， 200 r·min-1振蕩20 min，靜置30 min，得到上清液。取上清液涂布于分離培養(yǎng)基，將平板倒置于55 ℃的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。長出菌落后，進行多次平板劃線直至純化。篩選得到的菌株于相應的試管中斜面4 ℃保存。

1.2.2 菌株制備

在250 mL錐形瓶中裝入配置好的LB培養(yǎng)基，分別接入保存的單菌，貼好標簽，55 ℃、150 r·min-1振蕩培養(yǎng)24 h，5 000 r·min-1離心10 min。倒掉培養(yǎng)基，加入配置好的質量分數(shù)0.85%的生理鹽水振蕩搖勻，離心。重復清洗3次后，用超純水代替生理鹽水再進行該步驟，離心后收集菌體備用。

1.2.3 菌株篩選

以脫水污泥為主材料，根據(jù)C/N，配一定質量的鋸末制成堆肥原料(C/N在25～30之間，水分含量在60%左右)，充分混勻后，分裝于250 mL錐形瓶中，每瓶20 g。按5%接種量接種各菌株，55 ℃、170 r·min-1振蕩5 d。測定污泥有機質降解率和水分去除率，同時設置不接種菌株組作為空白對照，篩選出降解效率高的菌株。

表1堆肥原料成分

Table1Main composition of composting raw materials

試驗材料Experimental materials含水率Water content/%pH有機碳Organic carbon/%全氮Total nitrogen/%C/N脫水污泥 Dehydrated sludge78.157.6735.304.877.25鋸末Sawdust27.367.4645.470.35131.78

將篩選出的4株降解率較高的菌株，按照等比例分別進行兩兩組合、三者混合或全混合，統(tǒng)一采用5%的接種量，同前述方法，篩選出降解效率高的菌株組合。

1.2.4 菌株鑒定

菌株的形態(tài)及生理生化鑒定方法參考《微生物學實驗》[5]和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[6]。對菌株進行生物學鑒定，待測目的菌株以菌液為模板，采用通用引物27F/1492R進行16S rDNA的PCR擴增。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共24個循環(huán)；72 ℃保持10 min，10 ℃終止。將擴增后的PCR產物送上海美吉生物公司測序，測序結果提交NCBI數(shù)據(jù)庫，并利用Blast程序與基因庫中的16S rDNA序列進行比對分析，對各菌株進行初步鑒定。

1.2.5 污泥高溫堆肥試驗

以脫水污泥為主要材料，加入鋸末調節(jié)初始含水率至60%左右、C/N在25～30之間。以1.2.3節(jié)選定的菌株組合作為試驗材料，分別按照質量分數(shù)3%、5%和10%的比例添加于堆體中，并設置不加菌種組合的空白組，每個堆體3.5 kg，其他試驗條件相同。試驗持續(xù)21 d，每2 d翻堆1次。每天測定堆體溫度，同時記錄室溫。每隔1 d取樣，測定含水率、pH值、有機質含量，以及種子發(fā)芽指數(shù)。

1.2.6 指標測定

溫度采用水銀溫度計進行測量；含水率采用烘箱干燥法測定，105 ℃烘干至恒重；pH值參照NY 525—2012中方法測定；種子發(fā)芽指數(shù)參照GB/T 23486—2009中方法測定；有機質含量參照文獻[7]方法測定。

2 結果與分析

2.1 菌株分離篩選

2.1.1 單菌株降解效果比較

由圖1可知，經過5 d的降解，空白組有機質降解率為22.37%，投加外源菌的各試驗組的有機質去除率均高于空白組，其中，有機質去除率最高的菌株為W4(近50%)，其次是T1、T2和G1，有機質去除率都在35%左右，剩余菌株的有機質去除率均在30%左右。相對于張小娟等[8]模擬堆肥5 d最高24.7%的有機質降解率，本試驗供試菌株的有機質降解率均在較高水平。W4菌株的有機質降解率最高，這可能是因為其分離自脫水污泥，更適應于污泥環(huán)境。T1、T2和G1菌株均分離自55 ℃以上的高溫環(huán)境，因此在試驗條件下也較適應，但對污泥中有機質的降解能力不如W4。

與有機質去除率的結果類似，投加外源菌的各試驗組的水分去除率也都高于空白組，水分去除率最高的菌株同樣為W4，去除率23.37%，是對照組的1.9倍，G1、T1和T2菌株試驗組的水分去除率在16%左右，約為對照組的1.3倍。王亮等[9]堆肥試驗5 d的最高水分去除率為14.8%，與之相比，本試驗中供試菌株的水分去除率亦較高。

對比水分去除率和有機質降解率的結果發(fā)現(xiàn)，兩者變化趨勢一致，即有機質降解率越高的處理，其水分去除率也相對越高。這可能是由于微生物降解有機質的過程中釋放的熱量使水分揮發(fā)，有機質降解越多，產生的熱量越多，對水分去除的作用亦越強。綜合前述試驗結果可知，G1、T1、T2、W4是本次試驗分離鑒定出的優(yōu)勢菌，其中，以W4菌株對污泥的有機質降解率最高。

2.1.2 菌株組合降解效果比較

單一的細菌、真菌、放線菌群體，無論其活性多高，在加快堆肥化過程中的作用都比不上混合微生物菌群的共同作用[10]。從圖2可知，各菌種組合中，有機質去除率最高的為H11處理，即將G1、T1、T2、W4以1∶1∶1∶1的比例混合，在試驗條件下有機質去除率高達55.69%，是空白對照組的2.63倍。H7處理的有機質降解率也較高，與H11處理接近。水分去除率最高的處理同樣為H11，去除率達26.98%，是空白對照組的2.16倍，其次是H7處理，去除率25.51%。

與單菌株試驗結果相比，H11處理的有機質降解率和水分去除率提升進一步提高，效果更佳。

2.2 菌種鑒定

對篩選出的4株菌(G1、T1、T2、W4)進行菌落形態(tài)和個體形態(tài)鑒定。上述4株菌在55 ℃下培養(yǎng)24 h，在固體培養(yǎng)基中均形成乳白色不透明菌落，顯微鏡下觀察為單獨桿狀菌。G1菌落假根狀，邊緣絲狀，表面扁平，較干燥。T1菌落假根狀，邊緣絲狀，表面凹陷，光滑，較干燥。T2菌落圓形，邊緣絲狀，表面隆起，粗糙，較干燥。W4菌落圓形，邊緣波狀，表面凸透鏡狀，光滑，較干燥。

圖1 不同菌株在污泥模擬堆肥條件下的有機質降解率和水分去除率Fig.1 Degrading rate of organic matter and water removal rate of different strains under simulated sludge composting

H1， G1T1; H2， G1T2; H3， G1W4; H4， T1T2; H5， T1W4; H6， T2W4; H7， G1T1T2; H8， G1T1W4; H9， G1T2W4; H10， T1T2W4; H11， G1T1T2W4.圖2 不同菌株組合在污泥模擬堆肥條件下的有機質降解率和水分去除率Fig.2 Degrading rate of organic matter and water removal rate of different strain combinations under simulated sludge composting

由表2可以看出，4株菌均為革蘭氏陽性菌，細胞壁厚，在面對不良生存條件下，可更好地保持細胞外形，抑制機械和滲透損傷從而保護細胞。G1菌株的甲基紅試驗結果為陰性，與葡萄糖氧化發(fā)酵實驗結果為產堿菌株相對應，而T1、T2和W4菌株均能分解葡萄糖產酸，甲基紅試驗結果為陽性，并與葡萄糖氧化發(fā)酵試驗結果為發(fā)酵菌株相對應。4株菌均能水解淀粉，產硫化氫，這也是菌落形成過程中聞到輕微臭味的原因，不過味道較輕，不影響后續(xù)使用。4株菌均不能分解纖維素或使明膠液化，說明菌株在遇到纖維素、蛋白質大分子有機物時，仍需與其他微生物配合進行作用。

對4株菌進行16S rDNA分析，結果顯示，G1、T1、T2、W4分別與嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusthermoamylovorans)、嗜熱芽孢桿菌(Bacillusthermolactis)、芽孢桿菌(Bacillussp. TAT112)、芽孢桿菌(Bacillussp. HR1)的一致性均達到99%， 4株菌均屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)。

2.3 污泥高溫堆肥試驗

2.3.1 堆肥過程中堆體溫度的變化

堆肥溫度變化能夠反映不同階段微生物的代謝活性，是堆肥過程最直觀也是最重要的參數(shù)，也是決定堆肥能否順利進行并完成的重要因素。由圖3可知，4個處理堆體的變化趨勢一致。整個堆肥過程可以根據(jù)溫度不同分為3個階段：0～2 d，升溫階段；2～4 d，高溫階段；4～21 d，降溫階段。在適宜的含水率、C/N和氧氣濃度下，微生物通過分解有機物產生大量的熱量，使堆體迅速升溫，在堆肥的第2天，加入菌株組合的3個堆體溫度迅速升高，達到55～63 ℃，其中，以添加3%菌株組合的處理堆溫最高(63 ℃)，隨著菌株組合添加量的提高，堆體所達到的最高溫度降低。這可能是由于所加入的微生物量過多，與污泥中的土著微生物形成競爭關系，無法維持菌種之間的生態(tài)平衡，或者是由于加入的微生物之間因生存競爭而大量死亡所致[11]?？瞻捉M的最高堆溫雖然也達到了53 ℃，但升溫幅度明顯低于加入處理組。加入菌株組合的3個堆體堆溫在55 ℃以上維持4 d，能夠起到殺滅致病微生物的作用。堆肥21 d后，4個堆體的溫度趨于穩(wěn)定，較接近環(huán)境溫度，說明堆肥過程結束?？傮w來看，加入微生物菌株組合可以提高堆肥升溫速率和最高溫度，延長高溫期。

2.3.2 堆肥過程中堆體含水率的變化

表2菌株生理生化特征

Table2Physical and biochemical character of strains

檢測指標Measurement index菌株StrainG1T1T2W4革蘭氏染色Gram stain++++甲基紅試驗Methyl red test-+++乙酰甲基甲醇試驗Voges-Proskauer test----淀粉水解試驗Starch hydrolysis test++++檸檬酸鹽試驗Citrate test----明膠液化試驗Gelatin liquefaction test----葡萄糖胺試驗Glucosamine test+--+纖維素分解試驗Cellulose decomposition test----葡萄糖氧化發(fā)酵試驗Glucose oxidative fermentation test產堿Alkali-producing發(fā)酵Fermentation發(fā)酵Fermentation發(fā)酵Fermentation產硫化氫試驗Hydrogen sulfide production test++++半固體穿刺試驗Semi-solid puncture test無None擴散Diffused擴散Diffused擴散Diffused

+表示陽性，-表示陰性。

+ indicated positive; - indicated negative.

水分是影響堆肥物料腐熟速度的重要參數(shù)，合適的水分是保持微生物最佳活性的必要條件。由圖4可知，4組堆體的含水率均呈下降趨勢，接種菌株組合的堆體含水率下降速度明顯快于空白組，尤其在前3 d表現(xiàn)較為突出，之后變化較為平緩。各處理中，以3%添加量的堆體效果最好，含水率下降了18.9%，是空白組的1.45倍，高于張小娟等[8]堆肥中10.27%的水分去除率。微生物在分解有機物的同時產生大量熱量，使堆體溫度升高，加快了水分散失[12]。空白組的含水率也呈下降趨勢，是污泥中本身所含微生物所致，但由于土著微生物在堆肥過程中活性較差，整體的含水率變化較為平緩。

2.3.3 堆肥過程中堆體pH的變化

圖3 堆肥過程中堆體溫度的變化Fig.3 Dynamics of temperature during composting

圖4 堆肥過程中堆體含水率的變化Fig.4 Dynamics of water content during composting

堆肥過程中堆體微生物的有機降解活動，需要在一個適宜的酸堿條件下進行。研究認為，堆肥最適宜的pH范圍為5.5～8.0，由圖5可知，4個堆體的pH值均處于此范圍之內，且均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，與弓鳳蓮等[13]研究結果一致。這是由于：堆肥初期微生物氨化作用分解含氮化合物，產生大量不能及時揮發(fā)的氨氣，導致物料的pH增大；堆肥后期氨化作用減弱，而硝化作用增強，同時有機物分解產生有機酸，故致pH下降。對照圖3可以看出，高pH環(huán)境的維持時段與高溫維持時段基本一致，都是由微生物分解有機物造成的，該時段正值微生物，尤其是嗜熱微生物的活躍期。3%添加量的堆體溫度最高，但其堆體pH值并未明顯高出其他堆體，這有利于減少堆肥過程中NH3的揮發(fā)，保持堆肥肥效。

2.3.4 堆肥過程中堆體有機質含量的變化

堆肥過程中有機物在微生物的作用下會分解為CO2、水等小分子物質，同時又會合成新的物質——腐殖酸，所以在堆肥過程中，有機質的含量是不斷減少的。從圖6可以看出，4個堆體的有機質含量均呈現(xiàn)整體下降趨勢，加入菌株組合的處理相對于空白組，其有機質含量在初始情況下變化幅度小。這可能是由于加入微生物菌株組合后，需要與污泥中原有的微生物群落進行相互適應。加入微生物菌株組合的堆體在整個堆肥過程中有機質降解率波動較小，相對穩(wěn)定。在整個堆肥過程中，4個堆體中的有機質都得到了有效的分解，最終的有機質含量在74%～78%。其中，3%添加量堆體的有機質含量在21 d內由最初的87.9%下降到74.85%，高于宮曉梅等[14]和孫干等[15]試驗結果，說明選定的微生物菌株組合可以加快堆體中有機物的分解。

2.3.5 堆肥過程中堆體種子發(fā)芽指數(shù)的變化

種子發(fā)芽指數(shù)是表征堆肥有無毒性的重要指標，種子發(fā)芽率越高則堆體毒性越小，腐熟度越好。一般情況下，種子發(fā)芽指數(shù)大于80%可認為堆肥達到完全腐熟，對種子基本無毒性[16]。由圖7可知，添加微生物菌株組合的堆體，種子發(fā)芽指數(shù)呈穩(wěn)定增長趨勢，添加3%、5%、10%菌種組合的堆體自15 d起，其種子發(fā)芽指數(shù)陸續(xù)達到80%以上，達到完全腐熟，堆肥結束時，其種子發(fā)芽指數(shù)分別為134.10%、118.58%、103.36%，以3%添加量處理的種子發(fā)芽指數(shù)最高，堆體毒性最小，而空白組最終種子發(fā)芽指數(shù)低于50%，未達到腐熟標準。這說明選定的微生物菌株組合能快速有效地分解有毒物質，縮短堆肥周期。

圖5 堆肥過程中堆體pH的變化Fig.5 Dynamics of pH during composting

圖6 堆肥過程中堆體有機質含量的變化Fig.6 Dynamics of organic matter content during composting

圖7 堆肥過程中堆體種子發(fā)芽指數(shù)的變化Fig.7 Dynamics of germination index during composting

3 小結

本研究共篩選出4株污泥高效降解菌株，經鑒定，均屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)，將其以相同比例混合，并以不同劑量添加至污泥堆肥中，結果表明，當添加量為3%時，堆肥效果最優(yōu)，堆溫升高，高溫期延長，且堆肥周期縮短，所選定的菌株組合在污泥堆肥中有一定的應用潛力。