葛逸盟 張玉瑩 林怡婷 姚義凡 王雪珩 王月丹

（北京大學基礎醫(yī)學院免疫學系 北京 100191）

2018年10月30日， 瑞典皇家科學院宣布，將2018年諾貝爾化學獎的一半獎金授予美國科學家喬治·史密斯（G. Smith）及英國科學家格雷戈里·溫特爾爵士（Sir G. Winter），以表彰他們在發(fā)明及應用噬菌體（phage）展示技術中作出的貢獻［1］。什么是噬菌體展示技術？這個技術對人類的重要性究竟有多大？

1 噬菌體與噬菌體展示技術的發(fā)明

從字面含義上看，噬菌體是指能“吃掉”細菌的病毒，即一類能感染細菌、真菌、放線菌及螺旋體等微生物的病毒的總稱［2］。噬菌體的體積很小，形態(tài)因種類不同而存在差異，一般多為蝌蚪形，也可呈微小的球形或細長桿狀。 大多數(shù)噬菌體為有尾巴的二十面體結(jié)構(gòu)（圖1），也有部分噬菌體沒有尾部結(jié)構(gòu)。 其中，衣殼蛋白規(guī)律排列組成了噬菌體二十面體的頭部， 其中含有遺傳物質(zhì)——核酸。 而絲狀噬菌體外形呈線狀，沒有明顯的頭部結(jié)構(gòu)，其衣殼蛋白顆粒組成的盤旋狀結(jié)構(gòu)形成了外殼，包裹著噬菌體的核酸。

圖1 噬菌體的模式圖

目前， 根據(jù)基于病毒基因測序的噬菌體蛋白組樹（phage proteomic tree，PPT）分類法，可將噬菌體分為光滑噬菌體、囊狀噬菌體、絲狀噬菌體、微小噬菌體、短尾噬菌體、長尾噬菌體、肌尾噬菌體和Fuselloviridi 等8 種［3］（表1）。 1915年英國微生物學家托特（Federick William Twort）首先在金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)中， 觀察到了噬菌體殺死細菌的現(xiàn)象［2］。作為細菌的天敵，噬菌體很快就被用于對抗細菌感染的治療中。 1919年，人們采用噬菌體療法在法國治療兒童痢疾取得了成功［4］。 后來人們又相繼發(fā)現(xiàn)，噬菌體可感染霍亂弧菌和炭疽芽孢菌等多種病原細菌， 并可將這些宿主病原菌裂解，成為治療這些病原菌感染相關疾病的特效藥物，成為抗感染治療的有效方法之一。隨著抗生素的發(fā)明和使用，利用噬菌體進行治療細菌感染的方法一度陷入低谷。但進入21 世紀以來，因為細菌對抗生素產(chǎn)生耐藥的問題越來越嚴重，噬菌體治療再次進入了人們的視野，并在耐藥細菌和條件性致病細菌感染的治療中取得了初步的勝利［5］。

這次噬菌體成為諾貝爾化學獎的關鍵詞，卻不是因為其抗菌的作用， 而是因為有人將其變成了能夠展示外源性基因片段編碼蛋白及其功能的“展柜”。 1985年，喬治·史密斯首先在Science雜志上發(fā)表了題為《絲狀融合噬菌體：可以在病毒表面表達克隆抗原的新表達載體》的文章（圖2）。 這標志著一種可用于大規(guī)模高通量蛋白質(zhì)之間相互作用研究（特別進行抗原表位和特異性抗體的篩選與鑒定）的新型表達載體系統(tǒng)誕生了［6］。在此基礎上，以格雷戈里·溫特爵士為代表的科學家將其應用于抗體的人源化改造等生物學領域的研發(fā)中， 極大推進了疫苗和基因工程化抗體等新型生物制品研發(fā)的進展， 使抗體技術在繼雜交瘤技術和嵌合抗體技術之后， 進入了第3 次技術革命階段， 越來越多的抗體藥物逐漸進入了臨床治療應用的選擇范圍中［7］。 這也是溫特爾爵士能成為本次諾貝爾化學獎分享者的充分理由。

圖2 喬治·史密斯1985年在Science 雜志上發(fā)表的第1 篇噬菌體展示技術論文的雜志封面及目錄

2 噬菌體展示技術的原理及常用系統(tǒng)類型

為什么小小的噬菌體能成為展示各種外源性蛋白片段， 以及成為篩選抗原表位和特異性抗體的好工具？ 原來，人們可通過基因工程技術，將噬菌體中編碼衣殼蛋白信號肽的基因和衣殼蛋白多肽的基因切開， 將編碼外源性多肽或蛋白質(zhì)的基因片段插入到二者之間， 從而使外源性的多肽或蛋白質(zhì)序列與噬菌體衣殼蛋白形成融合蛋白分子，在信號的引導下，表達于噬菌體的表面。 此過程稱為“展示”（圖3）。由于噬菌體體積微小，表達在其表面被展示出來的外源性多肽或蛋白質(zhì)可保持相對獨立的空間結(jié)構(gòu)及生物學活性， 從而可通過適當?shù)奶赃x方法得到與靶分子親和性最強的可結(jié)合序列，并用于各種篩選、鑒定及生物學功能的研究與實踐中。

圖3 噬菌體展示系統(tǒng)的模式圖

一般制備表達特異性蛋白質(zhì)或多肽的噬菌體并進行篩選的方法分為以下幾步：

①制備大量噬菌體克隆的展示文庫， 每個噬菌體表面展示一種特定的蛋白質(zhì)或多肽。

②以展示文庫為流動相， 以目的多肽或蛋白質(zhì)分子作為固定相， 使兩相相互接觸并發(fā)生相互作用。

③用緩沖液洗去不能與靶分子特異性結(jié)合的噬菌體，保留可以與靶分子特異性結(jié)合的噬菌體。

④將收集到的噬菌體用于侵染大腸桿菌進行進一步擴增， 產(chǎn)生一個富集池作為新一輪淘洗的展示文庫。

基于類似的展示原理， 科學家曾嘗試使用細菌（以大腸桿菌為例）［8］、酵母［9］或直接編碼質(zhì)粒DNA（肽鍵質(zhì)粒文庫）［10］作為蛋白質(zhì)或多肽分子的表達載體。 但由于這些系統(tǒng)仍然有賴于宿主細胞的轉(zhuǎn)換，它們并沒有成功地構(gòu)造出大量、多樣性的表達 文庫［11］。

噬菌體展示技術模擬了自然選擇過程， 能快速、 有效且經(jīng)濟地實現(xiàn)對靶分子特異性受體篩選的高通量選擇，并首次實現(xiàn)了將基因型與表型，以及分子結(jié)合活性與抗原可擴增性的結(jié)合。 在隨后20 世紀90年代新型治療學的研發(fā)中發(fā)揮了重要作用。 基因型-表型連鎖還可通過對噬菌體基因組中特定插入物的DNA 測序，快速確定特定結(jié)合肽或蛋白質(zhì)分子的氨基酸序列［11］。

迄今為止， 人們已開發(fā)了絲狀噬菌體展示系統(tǒng)、T4 噬菌體展示系統(tǒng)， 以及λ 噬菌體展示系統(tǒng)等多種不同的噬菌體展示系統(tǒng)。

絲狀噬菌體展示系統(tǒng)是最早被發(fā)明和應用的噬菌體展示體系。絲狀噬菌體的基因編碼pⅧ、pⅢ、pⅥ、pⅦ和pⅨ等5 個衣殼蛋白， 其中pⅧ和pⅢ是最常用的展示蛋白（圖3）。 絲狀噬菌體載體較為穩(wěn)定，但轉(zhuǎn)化效率較低。如果展示的蛋白片段過大， 則會進一步降低pⅢ蛋白與大腸桿菌的性纖毛之間的相互作用， 使其感染宿主大腸桿菌的能力進一步下降， 需要通過應用輔助噬菌體等方法進行改善［12］。

T4 噬菌體展示系統(tǒng)是一種比較常用的展示系統(tǒng)。在進行展示的時候，人們一般將外源性蛋白片段與T4 生命非必需衣殼蛋白SOC 和HOC 融合，這2 個蛋白分布于噬菌體的正二十面體表面，具有很多拷貝， 且不影響T4 噬菌體的衣殼組裝，是良好的展示蛋白結(jié)構(gòu)。 同時，T4 噬菌體基因組為線性雙鏈DNA，在宿主細胞內(nèi)組裝成為病毒顆粒。在此過程中，展示蛋白不需要通過質(zhì)膜和細胞分泌過程，因此，可廣泛應用于包括不能被大腸桿菌分泌的復雜蛋白在內(nèi)的各種多肽和蛋白質(zhì)的展示研究。

λ 噬菌體具有兩端不閉合的線形雙鏈DNA組成的基因組， 外源性多肽或蛋白質(zhì)主要基于其頭部的D 蛋白和尾部的V 蛋白進行展示，這2 個蛋白在噬菌體上的拷貝數(shù)分別為405～420 和192個，能對外源性多肽或蛋白質(zhì)進行多拷貝的表達。λ 噬菌體不僅在宿主細胞內(nèi)完成組裝， 無需分泌過程，且該系統(tǒng)還能展示100 kD 以上的活性蛋白大分子及對宿主細胞具有毒性蛋白質(zhì)。同時，憑借D 蛋白的分子伴侶作用，λ 噬菌體系統(tǒng)還能在大腸桿菌等原核細胞中， 高水平表達和展示多種具有生物學活性的真核細胞蛋白質(zhì)。

3 噬菌體展示技術的應用與展望

噬菌體展示技術自誕生以來， 被廣泛應用于各個生物醫(yī)藥領域的研究與開發(fā)之中。其中，抗體藥物的研發(fā)是噬菌體展示技術最為令人矚目的成就。 2002年，通過噬菌體展示技術，人們成功開發(fā)了完全人源化的抗腫瘤壞死因子單克隆抗體——阿達木單抗（Adalimumab，商品名為修美樂），用于類風濕性關節(jié)炎和炎癥性腸病等自身免疫性疾病的治療［13］。 目前，該藥已在全球96 個國家上市銷售，覆蓋的適用病種達到了14 個，其2017年的銷售額更是高達180 多億美元， 是目前世界上最為暢銷的藥物。

此外，因具有簡便、有效和易于控制等優(yōu)勢，噬菌體展示技術還在各種病原體（包括病毒、細菌和寄生蟲）感染機制的研究、新疫苗的研發(fā)、腫瘤免疫過程的探索、 自身免疫性疾病的診斷與治療等應用領域，以及蛋白質(zhì)相互作用、細胞信號轉(zhuǎn)導和蛋白質(zhì)組學等基礎研究中， 發(fā)揮了極為重要的應用與研究價值， 是解決這些生物醫(yī)學問題必不可少的科學工具。

目前，噬菌體展示技術還存在著庫容有限、長片段表達易發(fā)生結(jié)構(gòu)的隨機折疊而影響生物活性， 以及宿主菌對氨基酸修飾的障礙等問題［14］。因此，人們在該技術的基礎上，又進一步開發(fā)出了核糖體展示技術［15］和酵母蛋白展示系統(tǒng)［16］等有針對性的解決方案。 隨著現(xiàn)代生物醫(yī)學技術的不斷發(fā)展與進步， 該系統(tǒng)自身也將會得到不斷的改進與完善，最終為維護人類的生命健康，提供源源不斷的新思路與新發(fā)現(xiàn)。