章熙東 段志鵬

（南京外國語學校 江蘇南京 210008）

“學始于問，才能終究成為學問?！惫夂献饔米鳛榈厍蛏献钣幸饬x的合成代謝， 在高中生物學必修1 模塊中占據(jù)重要地位， 是教師和學生公認的重、 難點， 可挖掘的素材多。 在該模塊學習過程中，學生已不滿足于“秋天葉片變黃是因為葉綠素容易受低溫破壞”的問題解答，也不滿足于“葉綠素作為天然色素不宜添加在酸性食品中”的答案呈現(xiàn)（2012 江蘇小高考題目），學生更注重“低溫和pH 值是如何影響葉綠素含量， 進而影響光合活性”的深度學習和過程體驗，用問題喚醒問題。

STEM 教育目標是整合各領域知識、 技能，將知識的學習與師生生活實踐結(jié)合起來， 通過科學探究的實踐解決現(xiàn)實生活的實際問題， 培養(yǎng)創(chuàng)新型人才。 《普通高中生物學課程標準》明確指出生物科學教育的核心任務就是培養(yǎng)學生必備的、可持續(xù)發(fā)展的生物科學素養(yǎng)， 將STEM 整合到教學實踐中，通過探究類學習，加深學生對生物學概念的理解，提升應用知識的能力。因而在筆者在所開設的《STEM 生物創(chuàng)新實驗》選修課上，帶領學生通過研究不同pH 和低溫脅迫對微囊藻葉綠素a含量及光合活性的影響， 探討藍藻對不同脅迫的適應性反應及其生理機制，符合新課改理念，培養(yǎng)了學生的核心素養(yǎng)。

1 實驗背景

光合作用是植物（包括藻類）最基本的生命活動，將光能轉(zhuǎn)變?yōu)榛瘜W能，并以有機物形式儲存。葉綠素在光合作用中起到吸收、傳遞、轉(zhuǎn)化光能的作用，葉綠素的含量與植物的光合速率密切相關，反映植物生長狀態(tài)。 干旱、低溫、元素缺乏等外界因素都可以通過影響葉綠素的含量影響光合速率。 因此脅迫條件下的葉綠素含量測定對植物的光合生理與逆境生理具有重要意義。

光合活性表征的是藻細胞光合系統(tǒng)在一定條件下的狀態(tài)，受到科學家普遍關注。 葉綠素熒光，作為光合作用研究的探針， 包含了許多光合信息，幾乎所有光合作用過程的變化均可通過葉綠素熒光反映。 藻類細胞的光合活性通?？捎萌~綠素熒光表征體現(xiàn)，經(jīng)過暗適應的藻細胞在低強度測量光條件下會發(fā)出初始熒光F0，經(jīng)過飽和脈沖高光強后發(fā)出最大熒光Fm和Fv（最大可變熒光）。Fv/Fm表征的是暗適應下PSⅡ（光系統(tǒng)Ⅱ）反應中心完全開放時的最大光合速率。 在非脅迫條件下，此參數(shù)變化很小，但在脅迫條件下，此參數(shù)變化較大，反映PSⅡ內(nèi)在機制的變化。 Fv/Fm常作為表達藻類光合活性是否受損的敏感性指標。 通常當藻類受到脅迫時，葉綠體中的光系統(tǒng)Ⅱ是首先而且也是主要損害的部位。 熒光測定技術不需破碎細胞，不傷害生物體，因此通過研究葉綠素熒光間接研究光合作用的變化是一種簡便、 快捷、可靠的方法。

2 材料與方法

2.1 藻種選擇 銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）是藍藻水華的主要藻種，喜溫（25°C 左右）喜堿（pH 值為10 左右）環(huán)境，易聚集成團，對環(huán)境危害大。 實驗用藻種購自武漢水生所的淡水藻種庫（FACHB-469）。

2.2 實驗方法 用0.1 mol/L 的HCl 和0.1 mol/L的NaOH 調(diào)節(jié)藻液的pH，將pH 值調(diào)整為3、6、12后靜置30 min，低溫組將藻液放置于4℃處理30 min，同時設置不處理組為對照組。 每組設置3個平行。

2.3 指標測定

1）葉綠素a 含量測定。將5 mL 藻液經(jīng)玻璃纖維濾膜抽濾， 取出帶有浮游藻類的濾膜后裝入具塞玻璃試管中，加入5 mL 95%乙醇溶液，加塞后在4℃下浸提24 h。 將提取后的液體轉(zhuǎn)入離心管中6 000 g 的離心速度下離心15 min， 收集上清液，將上清液在分光光度計上，用10 mm 光程的比色皿，分別讀取664 nm、648 nm 波長處的吸光值，并以95%乙醇作為空白吸光度測定，對樣品吸光度進行校正。

2）葉綠素a 含量計算。 葉綠素a 含量按如下公式計算［1］：Chla（μg／mL）＝13.36A664-5.19A648

3）光合活性測定。 取2 mL 藻液，暗適應20 min，采用葉綠素熒光儀（AquaPen-C AP-C100）測定藻細胞葉綠素a 熒光， 測得參數(shù)最大熒光（Fm）、最小熒光（F0）、可變熒光強度Fv（Fm-F0）、PSⅡ原初光能轉(zhuǎn)換效率（Fv/F0）、PSⅡ的潛在活性（Fv/Fm）。

3 結(jié)果與分析

3.1 低溫對葉綠素a 含量的影響 圖1結(jié)果顯示， 對照組葉綠素含量為4.48 μg/mL， 低溫組為4.05 μg/mL，低溫處理可以減少藻細胞的葉綠素a含量，但降低的幅度較小。低溫可以抑制葉綠素合成有關酶的活性，從而影響葉綠素的生物合成；低溫可能改變?nèi)~綠體的超微結(jié)構(gòu)， 打破了葉綠素酶與其底物葉綠素在空間位置上的隔離從而促進了葉綠素的分解； 也可能通過影響某些同工酶的活性來影響葉綠素的合成和降解。此外，也可能是由于低溫的誘導，使藻體中產(chǎn)生了一些新的蛋白質(zhì)，這些新的蛋白質(zhì)保持了脫鎂螯合酶的活性從而促進了葉綠素的分解［2］。

圖1 低溫處理下葉綠素α 濃度變化

3.2 pH 對葉綠素a 含量的影響 通過分析發(fā)現(xiàn)，不同的pH 處理造成了葉綠素a 含量不同程度降低（圖2），當pH 為12 和6 時，葉綠素含量為4.29 和4.13 μg/mL；pH 為3 時葉綠素含量為0.20 μg/mL，此時藻體合成葉綠素受到明顯破壞。 藻類的葉綠素和其他生命物質(zhì)一樣，需經(jīng)歷合成和分解，在此過程中，藻細胞所處的環(huán)境對其是有影響的，例如光照等條件適應會促進合成， 反之則促進其分解［3］。葉綠素的生物合成過程中，絕大部分都需要酶的參與，pH 可能會影響到這些酶的活力， 從而影響葉綠素的含量。 pH 脅迫導致葉綠素含量的降低，從而降低了藻細胞捕捉和利用光能的能力，同時也影響了光能在葉綠體中的分配。

圖2 不同pH 下葉綠素a 濃度變化（對照組為pH＝10）

3.3 低溫對藻類光合活性的影響 Fv/F0和Fv/Fm分別反映PSⅡ反應中心內(nèi)原初光能轉(zhuǎn)化效率和PSⅡ潛在的光化學活性。 當藻類暴露在環(huán)境壓力下時，F(xiàn)v/Fm值降低，即表明有光抑制現(xiàn)象或環(huán)境壓力使PSⅡ反應中心部分或全部受損， 抑制了光合作用的原初反應，阻礙了光合電子傳遞過程。 本實驗結(jié)果中PSII 活性的抑制可以從快速葉綠素熒光誘導動力學曲線和熒光參數(shù)看出（圖3、圖4）。結(jié)果表明，低溫脅迫下，藻細胞的Fv/Fm和Fv/F0值明顯降低（比對照組分別降低了16.0%和23.8%），反映出PSⅡ的原初光能轉(zhuǎn)換效率和潛在活性減弱。 說明低溫脅迫使藻類光系統(tǒng)PSⅡ活性中心受損，溫度脅迫還可以使光合電子傳遞過程受抑制， 光合電子傳遞速率下降。

圖3 低溫處理下的快速葉綠素熒光誘導動力學（OJIP）曲線

圖4 低溫處理下熒光參數(shù)變化（對照組為20℃）

3.4 pH 對藻類光合活性的影響 如圖5所示，熒光曲線的下降， 表明隨著pH 值的降低熒光產(chǎn)量顯著下降， 以及PSⅡ中QA、QB 和質(zhì)體醌之間電子傳遞受到了抑制。pH 對藻細胞熒光參數(shù)的影響如圖6所示。藻細胞的Fv/Fm和Fv/F0隨著pH 值的降低顯著下降， 說明強酸條件使藻細胞光系統(tǒng)PSⅡ活性中心嚴重受損，光合活性顯著降低。

圖5 不同pH 下的快速葉綠素熒光誘導動力學（OJIP）曲線

4 結(jié)論

溫度和pH 值是影響酶活性的重要因素，進而影響藍藻細胞內(nèi)的葉綠素含量和光合活性。

1）低溫對微囊藻葉綠素a 含量及光合活性造成了一定的影響，然而對其光合系統(tǒng)II 內(nèi)部的質(zhì)體醌和電子傳遞的影響不大。這表明，低溫對微囊藻細胞的影響可能主要表現(xiàn)為降低了細胞生陳代謝的整體速率， 從而導致其葉綠素a 合成速率的降低及光合活性的下降。

2）微囊藻耐堿性能力遠強于耐酸性能力。 這些結(jié)果可能為控藻技術的發(fā)展提供參考依據(jù)。

5 實驗反思

生物學新課程標準要求讓學生經(jīng)歷科學探究過程，習得科學研究方法，養(yǎng)成科學思維習慣，增強創(chuàng)新實踐能力， 基于STEM 理念的實驗教學恰恰提供了這樣一個實踐平臺。 STEM 教育以設計和探索為手段，運用科學與數(shù)學的思想，通過應用技術手段，在解決實際問題中進行知識學習［4］。學生利用現(xiàn)有的多學科知識，在自主發(fā)現(xiàn)問題、嘗試解決問題中進行新知學習，構(gòu)建概念體系，發(fā)展科學素養(yǎng)，點燃了研究激情，完成了深度研究，喚起了新的問題。 “重實踐”是新一輪課程改革所倡導的， 也是作為一線教師開展課程建設與教學改革的著力點和方向。