周 熙王 希劉水平羅 誠王宗成張瑞華

(1. 株洲市食品藥品檢驗(yàn)所，湖南 株洲 412000； 2. 湖南科技學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，湖南 永州 425199；3. 湖南炎帝生物工程有限公司，湖南 株洲 412007)

葛仙米學(xué)名擬球形念珠藻(Nostoc sphaeroides)，發(fā)育成熟后呈藍(lán)綠色膠質(zhì)狀，顆粒圓潤，玲瓏剔透[1]，為中國獨(dú)有的淡水野生藍(lán)藻，與發(fā)菜同屬。葛仙米不含藍(lán)藻毒素，是一種有較高藥用和食用價(jià)值的經(jīng)濟(jì)藍(lán)藻[2]，而且富含蛋白質(zhì)及豐富的多糖[3-5]。多糖類物質(zhì)往往具有許多生物活性，葛仙米多糖主要成分為半乳糖、甘露糖和木糖，對HCT116細(xì)胞增殖具有很強(qiáng)的抑制活性[3]。隨著技術(shù)的進(jìn)步和多糖研究的深入，葛仙米必將進(jìn)一步在食品、保健食品及醫(yī)療行業(yè)發(fā)揮巨大作用[6-7]?，F(xiàn)有多糖測定的標(biāo)準(zhǔn)方法均為化學(xué)法：SN/T 4260—2015《出口植物源食品中粗多糖的測定 苯酚—硫酸法》、NY/T 1676—2008《食用菌中粗多糖含量的測定》等。這2種方法經(jīng)過不斷優(yōu)化后，已經(jīng)廣泛用于植物、真菌等多糖的測定。但由于葛仙米中多糖含量高，而且黏度非常大，采用化學(xué)法分析時(shí)，多糖較難完全提取出來，測定結(jié)果不穩(wěn)定，無法準(zhǔn)確測定[7-9]。

對葛仙米有效成分多糖進(jìn)行檢驗(yàn)方法研究及質(zhì)量分析，可為企業(yè)原料規(guī)?；B(yǎng)殖、提取方法優(yōu)化篩選、進(jìn)一步的開發(fā)利用等提供試驗(yàn)依據(jù)，為食品藥品監(jiān)管部門對其質(zhì)量及安全風(fēng)險(xiǎn)評估提供準(zhǔn)確可靠的數(shù)據(jù)，為質(zhì)量監(jiān)控提供技術(shù)指標(biāo)。

目前，有關(guān)葛仙米多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)研究較少，其多糖的單糖組成是研究多糖生物活性的基礎(chǔ)[10-11]。1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，PMP)柱前衍生化高效液相色譜測定多糖含量的方法,目前被廣泛用于各種多糖的單糖組分檢測研究[12]。氣相色譜法亦可定性、定量分析多糖的組分和含量，一般是將多糖酸水解或甲醇醇解，再用衍生物法以增加其揮發(fā)性[13]。相比化學(xué)法，色譜法靈敏度應(yīng)更高、穩(wěn)定性更好，可定性、定量分析多糖的組分和含量[14]。但由于多糖的結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，其水解前處理方法多樣，水解條件各有不同，因此有必要找到穩(wěn)定的前處理方法，與化學(xué)法測定多糖含量進(jìn)行對比，同時(shí)對該方法的精密度、重現(xiàn)性、顯色穩(wěn)定性和加樣回收率進(jìn)行考察，為葛仙米多糖提取物中多糖含量的準(zhǔn)確測定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

葛仙米多糖提取物：湖南炎帝生物工程有限公司。其中Y1與Y2為野生葛仙米，Y3～Y6分別為春夏秋冬4個(gè)季節(jié)的樣品，樣品信息見表1。

表1 樣品Table 1 Sample

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平：MS205DU型，瑞士梅特勒-托利多國際貿(mào)易有限公司；

液相色譜儀：Thermo U3000型，美國賽默飛世爾科技公司；

pH計(jì)：FE-20型，瑞士梅特勒-托利多國際貿(mào)易有限公司。

1.3 HPLC法測定葛仙米多糖提取物的總糖含量

葛仙米多糖提取物的前處理水解條件經(jīng)過單因素考察確定，參考相關(guān)文獻(xiàn)資料[15-17]主要考察水解溫度高低、時(shí)間長短以及三氟乙酸對水解程度的影響；通過單因素的考察確定最佳的水解條件。

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)單糖溶液的配置及衍生 分別精密稱取甘露糖、氨基葡萄糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖及巖藻糖標(biāo)準(zhǔn)品100 mg于10 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得9種單糖的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。再配置成濃度分別為0.1，0.5，1.0，1.5，2.0 mg/mL的單糖混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取50 μL的單糖標(biāo)準(zhǔn)液及不同濃度梯度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，各加0.6 mol/L的NaOH溶液50 μL，置于5 mL的具塞試管中，漩渦混勻；再加0.5 mol/L的PMP(0.435 5 g/5 mL)甲醇溶液100 μL，漩渦混勻，在70 ℃的烘箱中避光反應(yīng)80 min，取出避光冷卻至室溫，加0.3 mol/L的HCl溶液100 μL中和，加水至2 mL，再加等體積的氯仿，漩渦混勻，靜置，棄去氯仿相，如此萃取3次。將水相用0.45 μm 微孔膜過濾后供HPLC進(jìn)行分析，作為定性定量的依據(jù)[15-18]。

1.3.2 葛仙米多糖提取物的水解 吸取0.1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5 mg/mL的多糖樣品溶液于2 mL的西林瓶中，加入濃度為3 mol/L的三氟乙酸(trifluoroacetic acid，TFA)溶液100 μL，充N2封管，在110 ℃的烘箱中水解4 h；冷卻后將水解液轉(zhuǎn)移至5 mL的離心管中，并用0.2 mL甲醇沖洗轉(zhuǎn)移殘余水解液，加0.2 mL甲醇后用N2吹干，如此重復(fù)加甲醇并用N2吹干3次，去除TFA，得水解樣品。取本品水解的殘?jiān)尤?0 μL超純水溶解殘?jiān)?，按照?.3.1”方法進(jìn)行衍生、中和、萃取，用0.45 μm微孔膜過濾后，超聲脫氣，進(jìn)行HPLC檢測分析[15-18]。

1.3.3 色譜條件 色譜柱：Welch Xtimate(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：以0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(用3 mol/L 氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至6.7)為流動(dòng)相A，乙腈為流動(dòng)相B，梯度洗脫(表2)；檢測波長：260 nm；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。

表2 梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution program

1.4 苯酚-硫酸法測定葛仙米多糖提取物的總糖含量

1.4.1 溶液的配置 精確稱取重蒸酚25.0 g，加水溶解后，轉(zhuǎn)移至500 mL的容量瓶中，稀釋至刻度處，混勻，得到質(zhì)量濃度為5%的苯酚溶液，將其保存在4 ℃中，備用。標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液配置：精準(zhǔn)稱取無水葡萄糖10.0 mg于100 mL容量瓶中，加入蒸餾水至刻度處、搖勻，配成葡萄糖溶液濃度為0.10 mg/mL，備用[19]。

1.4.2 標(biāo)曲的繪制 準(zhǔn)確吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.00，0.10，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00 mL置于25 mL的離心管中，補(bǔ)加水至2.0 mL，加入5%的苯酚溶液1.0 mL，混合均勻后，繼續(xù)加入濃硫酸10 mL，混勻后，沸水浴2 min，冷卻至室溫，在485 nm波長處以試劑空白為參比，1 cm比色皿測定吸光光度值[19]。以葡萄糖質(zhì)量為橫坐標(biāo)，吸光光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)曲，見圖1。

1.4.3 樣品中總糖的測定 稱取0.1 g的葛仙米多糖提取物在水中溶解，定容至100 mL(V1)。準(zhǔn)確吸取2 mL(V2)的葛仙米多糖提取物溶液置于25 mL的離心管中，加入10 mL無水乙醇，混勻，于4 ℃冰箱中靜置4 h，離心(5 000 r/min, 5 min)，棄去上清液，殘?jiān)? mL 80%乙醇洗滌，洗滌3遍，殘?jiān)芙舛ㄈ葜?5 mL(V3)[19]。準(zhǔn)確吸取前處理好的葛仙米多糖提取物1.0 mL(V4)，補(bǔ)加水至2.0 mL，然后照“1.4.2”方法測定吸光光度值，依照標(biāo)曲計(jì)算葛仙米多糖提取物的濃度，按式(1)計(jì)算總糖含量[19]。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 1 Standard curve of glucose

(1)

式中：

X——總糖含量，%；

m1——樣品中葡萄糖測定量，mg；

m2——樣品的質(zhì)量，g；

V1——樣品提取液的定容體積，mL；

V2——沉淀粗多糖所用溶液的體積，mL；

V3——粗多糖溶液體積，mL；

V4——測定樣品溶液體積，mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 單糖PMP衍生物的色譜圖及線性關(guān)系

單糖PMP衍生物的標(biāo)樣圖以及代表性樣品單糖衍生圖見圖2。表3表明：甘露糖、氨基葡萄糖、鼠李糖以及葡萄萄醛酸等9種單糖的衍生物在0.1～2.0 mg/mL時(shí)線性關(guān)系良好。

2.2 葛仙米多糖水解單因素試驗(yàn)

2.2.1 水解時(shí)間的考察 按“1.3”水解衍生多糖樣品，分別考察水解2，3，4，5，6 h多糖的水解程度。最后結(jié)果如表4所示，隨著水解時(shí)間的延長，單糖的總峰面積增加，水解4 h時(shí)最大，隨后減少。由此可見，水解4 h最佳。

表3 單糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 3 The monosaccharide of lineal relation

圖2 多糖水解樣品和標(biāo)樣衍生物的HPLC分離效果圖Figure 2 Separation of polysaccharide hydrolysate and standards derivatives by HPLC

2.2.2 TFA濃度的考察 照“1.3”項(xiàng)，水解衍生多糖樣品，分別考察不同濃度TFA(2，3，4，5，6 mol/L)對多糖水解的影響。如表5所示，隨TFA的濃度的增加，單糖的總峰面積先增加然后降低，當(dāng)TFA的濃度為3 mol/L時(shí)水解衍生結(jié)果最佳。

2.2.3 水解溫度的考察 照“1.3”項(xiàng)，水解衍生多糖樣品，分別考察不同溫度(100，110，120 ℃)對多糖水解的影響，如表6所示，根據(jù)峰面積總和的大小，確定110 ℃最佳。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取“1.3.1”和“1.3.2”的對照品溶液和樣品溶液，按“1.3.3”的色譜條件進(jìn)行分析，同時(shí)做空白試驗(yàn)，記錄色譜圖，9種單糖分離良好，理論板數(shù)均不低于5 000(見圖2)。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 儀器精密度 按“1.3.1”項(xiàng)下衍生混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，再依照“1.3.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，連續(xù)進(jìn)樣6針，計(jì)算其RSD，測定結(jié)果見表7。結(jié)果表明儀器的精密度良好。

2.4.2 精密度試驗(yàn) 分別精密量取同一對照品溶液50 μL，置于15 mL離心管中，共6份，按“1.3.1”項(xiàng)下衍生條件處理。然后，照“1.3.3”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行分析，計(jì)算甘露糖、氨基葡萄糖、鼠李糖以及葡萄糖醛酸等9種單糖衍生物的峰面積以及RSD值，測定結(jié)果見表8。結(jié)果表明本試驗(yàn)精密度良好，說明樣品水解衍生的處理方法可靠。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取同一對照品溶液50 μL，置于15 mL離心管中，按“1.3.1”項(xiàng)下衍生條件處理。放置在室溫條件下，分別于0，1，2，4，8，16，24，48 h，按照“1.3.3”的色譜條件進(jìn)行分析，計(jì)算9種單糖衍生物峰面積的RSD值，結(jié)果見表9。結(jié)果表明衍生后9種單糖溶液24 h內(nèi)均穩(wěn)定。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 吸取5 mg/mL的葛仙米多糖提取物樣品溶液0.1 mL，按“1.3.2”的試驗(yàn)方案，取樣6份水解衍生處理，然后照按“1.3.3”的色譜條件進(jìn)行分析，計(jì)算樣品中主要5種單糖的RSD，結(jié)果見表10。其重復(fù)性尚可，葡萄糖醛酸以及木糖的RSD偏高，可能是水解后的穩(wěn)定性稍差。

表4 水解時(shí)間對單糖峰面積的影響Table 4 The analysis of hydrolysis time (n=5)

表5 TFA濃度對單糖峰面積的影響Table 5 The analysis of TFA concentration (n=6)

表6 水解溫度對單糖峰面積的影響Table 6 The analysis of hydrolysis temperature (n=3)

表7 儀器精密度Table 7 The precision of instrument

2.4.5 回收率試驗(yàn) 吸取5 mg/mL的葛仙米多糖提取物樣品溶液0.05 mL，同時(shí)每份樣品中加入0.05 mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 mg/L)，按“1.3.2”的試驗(yàn)方案，取樣6份水解衍生處理，然后照按“1.3.3”的色譜條件進(jìn)行分析，計(jì)算樣品中主要9種單糖的回收率，結(jié)果見表11?；厥章试?0%～110%時(shí)，葡萄糖與甘露糖的回收率偏低。

2.4.6 檢出限試驗(yàn) 精密量取“1.3.2”項(xiàng)下的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 mg/L) 0.25 mL置于100 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻。按“1.3.1”的衍生條件處理。然后，照“1.3.3”的色譜條件進(jìn)行分析，以信噪比(S/N)為3計(jì)算9種單糖的檢出限為4.27～8.48 μg/mL。檢出限計(jì)算結(jié)果見表12，與化學(xué)法相比，HPLC方法的檢出限更低。

表8 精密度試驗(yàn)Table 8 The precision test (n=6)

表9 穩(wěn)定性試驗(yàn)Table 9 The stability test (n=7)

表10 重復(fù)性試驗(yàn)Table 10 The reproducibility test (n=6)

表11 回收率試驗(yàn)Table 11 The recovery test (n=6)

表12 檢出限Table 12 The detection limit (n=9) μg/mL

2.4.7 樣品測定 按“2.2”的方法制備對照品溶液和供試品溶液(共6批樣品)，按“2.1”的色譜條件進(jìn)行分析測定。以單糖的含量計(jì)算多糖的含量，選取6種主要的單糖來計(jì)算，即甘露糖、氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖以及木糖，9種單糖含量的計(jì)算結(jié)果見表13、14。同樣6批次樣品用化學(xué)法測定總糖含量，結(jié)果見表15。可以看出化學(xué)法測定結(jié)果整體數(shù)值偏高，平行試驗(yàn)結(jié)果差別較大。

表13 HPLC法樣品測定結(jié)果Table 13 The content determination of samples by HPLC (n=6)

表14 HPLC法單糖含量的計(jì)算結(jié)果Table 14 The content determination of monosaccharide by HPLC (n=6) mg/mL

表15 化學(xué)法測定總糖含量的計(jì)算結(jié)果Table 15 The content determination of polysaccharides by chemical method (n=6)

2.5 單糖含量結(jié)果分析

柱前PMP衍生高效液相色譜法測多糖，以單糖總量計(jì)算多糖，存在操作步驟較多，數(shù)值整體偏低的問題。但相較于化學(xué)法，該方法準(zhǔn)確可靠，線性關(guān)系良好，重復(fù)性和專屬性好，可以很好地完成葛仙米多糖提取物中的單糖組成及定性定量分析。雖然化學(xué)法操作步驟簡單、易行，但其測定值平行性差，檢出限不高，結(jié)果的可靠性較低。另外，按照上述所建立的水解衍生方法，并針對此方法進(jìn)行方法學(xué)考察，測定6批樣品，同時(shí)與化學(xué)法進(jìn)行了比較發(fā)現(xiàn)，其中野生的葛仙米多糖提取物多糖含量高于人工養(yǎng)殖的，夏秋季采樣的葛仙米多糖提取物所測多糖含量亦高于其他季節(jié)，可能是夏季葛仙米生長旺盛，存儲多糖含量較高。野生葛仙米的多糖提取物中的多糖含量明顯高于養(yǎng)殖的，可能有以下幾個(gè)原因：① 養(yǎng)殖的密度偏大；② 模擬野生環(huán)境可能有所欠缺；③ 經(jīng)緯度的問題，日照、溫度等有所影響。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用三氟乙酸水解葛仙米多糖提取物，對水解條件進(jìn)行了單因素考察。通過考察發(fā)現(xiàn)，在110 ℃下，采用3 mol/L 的三氟乙酸水解4 h，其水解效果更好。然后，進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，結(jié)果表明，相較于化學(xué)法新建立的分析方法可靠準(zhǔn)確、靈敏度高，可同時(shí)用于9種單糖的分析，且分離效果較理想。樣品測定結(jié)果顯示，葛仙米多糖提取物中主要含有甘露糖、氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖及木糖6種單糖，其中甘露糖、葡萄糖、半乳糖以及木糖含量較高，與莫開菊等[15]報(bào)道的結(jié)果類似，通過對比，發(fā)現(xiàn)葛仙米多糖提取物中有一種單糖種類不一致，其文中報(bào)道含有阿拉伯糖。經(jīng)加標(biāo)試驗(yàn)確認(rèn)，木糖與阿拉伯糖保留時(shí)間極為接近，樣品中峰的保留時(shí)間與木糖衍生物一致，最終確認(rèn)葛仙米多糖提取物中的單糖組成之一應(yīng)是木糖。不足之處在于所測樣品批次少，野生葛仙米的樣品難以收集，沒能比較不同月份以及不同年份野生和人工養(yǎng)殖的葛仙米中多糖含量的差異，如有大樣本的數(shù)據(jù)，更能找出其中的規(guī)律，為葛仙米的人工養(yǎng)殖提供科學(xué)的依據(jù)。

此外，現(xiàn)有研究表明葛仙米多糖的分子量與其生物活性存在直接關(guān)聯(lián)，但由于多糖結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，大部分研究都只是在一級結(jié)構(gòu)上。而葛仙米多糖的研究起步較晚，相關(guān)的生物活性研究亦較少。確定葛仙米多糖單糖的組成和含量可以為進(jìn)一步研究、開發(fā)葛仙米的相關(guān)活性提供理論基礎(chǔ)[3,10-11]。