楚愛(ài)景，程旭鋒，趙慧朵，王豐蓮

(河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院乳腺外科，河南 鄭州 136300)

乳腺增生病為乳腺常見(jiàn)病和多發(fā)病，是以乳房的疼痛或腫塊為主要臨床表現(xiàn)的一種既非腫瘤又非炎癥的良性改變，其發(fā)生與體內(nèi)激素失調(diào)有關(guān)，被認(rèn)為是乳腺癌癌前的1種良性病變，占女性全部疾病發(fā)病率的50%～70%，對(duì)女性的生命健康產(chǎn)生嚴(yán)重威脅[1-2]。乳腺增生屬于中醫(yī)學(xué)疾病乳中結(jié)核、乳癖的范圍，并認(rèn)為主要病機(jī)是氣滯和痰凝引起瘀血，在乳房部相互凝結(jié)，引發(fā)乳癖的發(fā)生[3]。中藥治療乳腺增生病的歷史由來(lái)已久，柴芍乳癖顆粒由柴胡、白芍、黨參、白術(shù)、茯苓、郁金、三七、當(dāng)歸、瓜蔞皮、浙貝母、王不留行、丹參和蒲公英等多味中藥組成，諸藥合用，共奏疏肝理氣、活血化瘀、散結(jié)止痛和健脾益氣之功。研究[4-6]顯示：柴芍乳癖湯能在一定程度上控制乳腺增生癥狀，可以明顯改善乳腺增生兔模型B超聲像，減輕雌兔乳腺增生程度，臨床上柴芍乳癖合劑可明顯改善乳腺增生患者的疼痛及全身伴隨癥狀，但目前尚無(wú)有關(guān)柴芍乳癖顆粒對(duì)乳腺增生組織產(chǎn)生影響的相關(guān)機(jī)制研究。因此，本研究通過(guò)探討柴芍乳癖顆粒對(duì)乳腺增生大鼠血清激素水平和乳腺組織中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和堿性成纖維細(xì)胞生成因子(bFGF)蛋白表達(dá)水平的影響，闡明其作用機(jī)制，為其進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究以及臨床推廣提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、藥品、試劑和主要儀器 雌性SD大鼠60只，SPF級(jí)，體質(zhì)量為200～220 g，9周齡，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(鄂)2010-0009。苯甲酸雌二醇(天津金耀氨基酸有限公司)，黃體酮和他莫昔芬片(上海復(fù)旦復(fù)華藥業(yè)有限公司)，柴芍乳癖顆粒(一方中藥配方顆粒，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供)，雌二醇(E2)、孕酮(P)、黃體生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)、催乳素(PRL)、促性腺激素釋放激素(GnRH)、VEGF和bFGF檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所有限公司)。病理組織切片機(jī)(德國(guó)Sartorius 公司)，Leica DMI4000B 倒置熒光顯微鏡(德國(guó)Leica公司)，Jouan BR4I 高速離心機(jī)(德國(guó)Hereaus 公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和動(dòng)物模型制備 60只大鼠隨機(jī)分為6組，每組10只：對(duì)照組，模型組，他莫昔芬組(4 mg·kg-1)，低(0.45 g·kg-1)、中(0.90 g·kg-1)和高(1.80 g·kg-1)劑量柴芍乳癖顆粒組。對(duì)照組大鼠腹腔注射生理鹽水0.05 mL，常規(guī)喂養(yǎng)，其余各組大鼠均腹腔注射苯甲酸雌二醇0.5 mg·kg-1，連續(xù)25 d；然后腹腔注射黃體酮注射液5 mg·kg-1，連續(xù)5 d，建立大鼠乳腺增生動(dòng)物模型[5]。對(duì)照組和模型組大鼠灌胃等體積蒸餾水，其他各組分別灌胃相應(yīng)劑量的藥物，連續(xù)給藥8周。

1.3 大鼠乳頭直徑和高度測(cè)量 用游標(biāo)卡尺精確測(cè)量大鼠第2對(duì)乳頭直徑和高度，并觀察其外觀。

1.4 血清采集和指標(biāo)測(cè)定 10%水合氯醛按腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血，4℃、3 000 r·min-1離心10 min，取血清，采用ELISA法檢測(cè)血清中E2、P、LH、FSH、PRL、GnRH、VEGF和bFGF的水平。

1.5 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)大鼠乳腺組織中VEGF和bFGF蛋白表達(dá)水平 無(wú)菌條件下，大鼠10%水合氯醛麻醉固定，摘下大鼠第2對(duì)乳房，于4%多聚甲醛固定，制作病理切片，HE染色，顯微鏡下觀察各組大鼠乳腺組織病理形態(tài)表現(xiàn)(每組選取染色清晰的圖片并用圖像分析系統(tǒng)拍片)；免疫組織化學(xué)法：依次滴加一抗、生物素化山羊抗大鼠IgG，DAB顯色，檢測(cè)各組大鼠乳腺組織中VEGF和bFGF的表達(dá)情況，采用Image ProPlus 6.0軟件測(cè)量每張片子陽(yáng)性蛋白染色面積的平均吸光度(A)值，以A值代表VEGF和bFGF蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠乳頭直徑和高度 對(duì)照組大鼠乳頭僅呈小米樣，柔軟，緊貼于皮膚上，乳頭高度和直徑無(wú)明顯變化；與對(duì)照組比較，模型組大鼠乳頭豎起較堅(jiān)實(shí)，充血，乳頭高度和直徑明顯增加(P<0.05)。與模型組比較，他莫昔芬組和低、中和高劑量柴芍乳癖顆粒組大鼠乳頭高度和直徑均明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 各組大鼠乳腺組織病理形態(tài)表現(xiàn) 與正常組比較，模型組大鼠乳腺組織中腺泡形狀不規(guī)則、分泌物增多、細(xì)胞明顯增生；與模型組比較，他莫昔芬組和低、中、高劑量柴芍乳癖顆粒組大鼠乳腺組織中腺泡形狀規(guī)則，分泌物減少，細(xì)胞增生程度減輕；與他莫昔芬組比較，高劑量柴芍乳癖顆粒組大鼠乳腺組織中腺泡形狀相對(duì)規(guī)則，分泌物減少，細(xì)胞增生程度減輕。見(jiàn)圖1(插頁(yè)四)。

表1 各組大鼠乳頭高度和乳頭直徑

Tab.1 Heights and diameters of nipples of rats in various groups (n=10,±s,l/mm)

*P<0.05 compared with control group;△P<0.05 compared with model group.

2.3 各組大鼠血清激素水平 與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清中E2、LH、PRL和GnRH水平明顯升高(P<0.05)，P水平明顯降低(P<0.05)，而FSH 水平略升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與模型組比較，低、中和高劑量柴芍乳癖顆粒組大鼠血清中E2、LH、PRL和GnRH水平均明顯降低(P<0.05)，同時(shí)P和FSH水平明顯升高(P<0.05)，且呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性；與他莫昔芬組比較，高劑量柴芍乳癖顆粒組各激素水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

2.4 各組大鼠血清中VEGF和bFGF水平 與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清中VEGF和bFGF 水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，低、中和高劑量柴芍乳癖顆粒組大鼠血清中VEGF和bFGF水平均明顯降低(P<0.05)；與陽(yáng)性藥他莫昔芬組比較，中和高劑量柴芍乳癖顆粒組VEGF水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，高劑量柴芍乳癖顆粒組大鼠血清中bFGF水平降低明顯(P<0.05)。 見(jiàn)表3。

2.5 各組大鼠乳腺組織中VEGF和bFGF蛋白表達(dá)水平 光鏡下觀察：VEGF和bFGF蛋白在大鼠乳腺組織細(xì)胞胞漿中染色為黃色和棕黃色。與對(duì)照組比較，模型組大鼠乳腺組織內(nèi)VEGF和bFGF蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)；與模型組比較，他莫昔芬組和中、高劑量柴芍乳癖顆粒組大鼠乳腺組織中VEGF和bFGF蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；與他莫昔芬組比較，中和高劑量柴芍乳癖顆粒組大鼠乳腺組織中VEGF和bFGF蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)。見(jiàn)圖2(插頁(yè)四)和圖3(插頁(yè)五)及表4。

表2 各組大鼠血清激素水平

*P<0.05 compared with control group；△P<0.05 compared with model group.

表3 各組大鼠血清中VEGF和bFGF水平

Tab.3 Levels of VEGF and bFGF in serum of rats in various groups [n=10,±s,ρB/(ng·L-1)]

*P<0.05 compared with control group；△P<0.05 compared with model group.

表4 各組大鼠乳腺組織中VEGF和bFGF蛋白表達(dá)水平

Tab.4 Expression levels of VEGF and bFGF proteins in breast tissue of rats in various groups (n=10,±s)

*P<0.05 compared with control group;△P<0.05 compared with model group;#P<0.05 compared with tamaxifen group.

3 討 論

乳腺增生發(fā)生多因內(nèi)分泌紊亂，與體內(nèi)激素失調(diào)有密切關(guān)聯(lián)，尤其是雌、孕激素比例失衡。雌激素長(zhǎng)期大量存在于乳腺組織，同時(shí)在不斷循環(huán)的月經(jīng)周期中，又缺乏孕激素的有效保護(hù)作用，導(dǎo)致乳腺小葉腺泡、導(dǎo)管過(guò)度增生，引發(fā)乳腺增生[3，8-9]。

西醫(yī)認(rèn)為乳腺增生與內(nèi)分泌激素紊亂等有關(guān)，目前尚未有特效療法。古今乳病多歸責(zé)于肝和胃，乳腺增生屬中醫(yī)“乳癖”范疇。中醫(yī)認(rèn)為乳腺增生與氣滯和精神因素有關(guān)，肝氣郁結(jié)、沖任失調(diào)、痰凝血瘀是主要病機(jī)，氣滯血不行，日久形成血瘀，久而久之形成結(jié)塊[10]。柴芍乳癖顆粒由多味中藥組成，方中柴胡、白芍及青皮疏肝理氣止痛、養(yǎng)血斂陰、散結(jié)止痛；黨參、白術(shù)、茯苓益氣健脾、利水滲濕；郁金活血止痛、行氣解郁；夏枯草消癖散結(jié)消腫，三七、當(dāng)歸活血補(bǔ)血，瓜蔞皮、浙貝母清熱化痰、理氣寬胸；王不留行活血通經(jīng)；丹參活血祛瘀止痛；蒲公英和山慈菇清熱解毒、化痰散結(jié)。諸藥合用，共奏疏肝理氣、活血化瘀、散結(jié)止痛、健脾益氣之功。現(xiàn)代藥理學(xué)研究[11]顯示：當(dāng)歸與柴胡對(duì)腫瘤生長(zhǎng)具有很好的抑制效果，蒲公英與山慈菇的被證實(shí)具有抗癌功效。

PRL是由垂體遠(yuǎn)側(cè)部的嗜酸性細(xì)胞產(chǎn)生的一種泌乳素，研究[12]表明：PRL具有促進(jìn)乳腺生長(zhǎng)發(fā)育和維持泌乳的作用，對(duì)下丘腦-垂體-卵巢軸可產(chǎn)生一定的抑制效果。乳腺作為PRL的靶器官，含有豐富的PRL受體。當(dāng)血中PRL異常升高時(shí)，會(huì)對(duì)黃體期P的分泌產(chǎn)生抑制作用，同時(shí)刺激E2的合成，導(dǎo)致E2/P比例失調(diào)，對(duì)乳腺組織產(chǎn)生不良刺激，引發(fā)乳腺組織的過(guò)度增生[13]。GnRH是由下丘腦合成的一種十肽激素，以脈沖分泌方式到達(dá)垂體前葉，刺激垂體細(xì)胞合成、分泌FSH和LH，而LH和FSH能夠刺激E2和P的合成和分泌[14]。研究[15]顯示：VEGF和bFGF水平與乳腺增生程度呈正相關(guān)關(guān)系。研究[16-18]表明：VEGF和bFGF可以促進(jìn)乳腺增生血管生成，為增生細(xì)胞生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣，并及時(shí)排泄代謝產(chǎn)物。靳亞慈[19]研究顯示：乳腺組織和血清中VEGF和bFGF的增多會(huì)引發(fā)乳房組織微循環(huán)障礙，VEGF和bFGF被激活后通過(guò)共同途徑促使乳腺增生病的發(fā)生。

本研究結(jié)果顯示：柴芍乳癖顆?？擅黠@降低乳腺增生模型大鼠血清E2水平，升高血清P和FSH水平，調(diào)節(jié)血清E2/P比值，同時(shí)降低血清LH、PRL、GnRH、VEGF和bFGF水平，改善乳腺增生模型大鼠的內(nèi)分泌激素紊亂，結(jié)合乳腺組織免疫組織化學(xué)結(jié)果，表明柴芍乳癖顆粒可明顯降低大鼠乳腺增生組織中VEGF和bFGF蛋白表達(dá)水平，這可能是其發(fā)揮抑制和減緩乳腺增生發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)制之一，本研究結(jié)果為紫芍乳癖顆粒在臨床廣泛應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。