陳炳鵬, 任 明, 李容杭, 韓 青, 王金成

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院骨科, 吉林 長(zhǎng)春 130041)

骨肉瘤是一種最常見(jiàn)的組織學(xué)原發(fā)性骨腫瘤，常發(fā)于青少年人群中。盡管近年來(lái)包括化療和手術(shù)治療在內(nèi)的現(xiàn)代多學(xué)科治療方法都在不斷的發(fā)展，骨肉瘤患者的5年生存率仍然只是維持在60%～70%[1-2]。最近隨著腫瘤相關(guān)信號(hào)通路和新型基因靶向治療的研究進(jìn)展，為預(yù)防和治療骨肉瘤提供了新的策略和途徑。目前與骨肉瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的關(guān)鍵基因包括FAS、Ezrin、CXCR4、COX-2、HER2、以及NOTCH和HES1等[3-5]。但是仍缺乏一個(gè)能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)骨肉瘤進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和對(duì)化療反應(yīng)性的標(biāo)志性分子。NOB1蛋白是26S蛋白酶體的一個(gè)亞單位，在蛋白酶功能和RNA代謝過(guò)程中發(fā)揮重要作用。研究[6-10]顯示：NOB1在多種腫瘤中異常表達(dá)且發(fā)揮重要功能。但是,NOB1在骨肉瘤中的功能及其分子機(jī)制尚不十分清楚。本研究應(yīng)用慢病毒介導(dǎo)的短發(fā)夾RNA(short hourpin RNA,shRNA)干擾技術(shù)建立抑制NOB1 mRNA表達(dá)的Lv-shNOB1-U2OS骨肉瘤細(xì)胞株，利用mRNA表達(dá)譜芯片對(duì)Lv-shCon-U2OS組和Lv-shNOB1-U2OS組細(xì)胞分別行表達(dá)譜分析，篩選出可能受NOB1調(diào)控的基因，并對(duì)差異基因進(jìn)行相關(guān)分析，為進(jìn)一步研究NOB1在骨肉瘤中的功能奠定分子基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株、主要試劑和儀器 Lv-shNOB1-U2OS細(xì)胞株及其相應(yīng)的對(duì)照細(xì)胞Lv-shCon-U2OS細(xì)胞株由本課題組建立。RNA LabChip○Rkits、RNA 6000 nano marker、表達(dá)譜芯片配套試劑盒、Gene Expression Hybridization Kit和Gene Expression Wash Buffer Kit均購(gòu)自美國(guó)Agilent Technologies公司，RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司, 胰蛋白酶和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。NanoDrop ND-2000和載物片洗缸為美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品，Agilent Bioanalyzer 2100生物分析儀、雜交爐和Agilent Scanner G2505C為美國(guó)Agilent Technologies公司產(chǎn)品。Feature Extraction軟件version 10.7.1.1和Genespring軟件version 12.5為美國(guó)Agilen Technologies公司產(chǎn)品。

1.2 定量PCR法檢測(cè)人NOB1基因的干擾效率 提取感染重組病毒Lv-shNOB1-U2OS細(xì)胞、感染空病毒Lv-shCon-U2OS細(xì)胞、未感染病毒的Saos-2細(xì)胞和U2OS細(xì)胞的總RNA，以總RNA為模板，β-actin為內(nèi)參照，用定量PCR法檢測(cè)細(xì)胞中NOB1 mRNA表達(dá)變化。Real-time PCR引物采用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)，送上海生工公司合成。引物序列如下：NOB1，上游引物 5′-GAAAGAACAACGCCCTGGAG-3′；下游引物 5′-CAGCCTTGAGATGACCTAAGC-3′；β-actin， 上游引物 5′-GTGGACATCCGCAAAGAC-3′；下游引物 5′-AAAGGGTGTAACGCAACTA-3′。

1.3 RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄 當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至95%融合度后，用無(wú)菌細(xì)胞刮分別刮取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的貼壁細(xì)胞；按照Trizol reagent試劑盒說(shuō)明書(shū)提取RNA；應(yīng)用QIAGEN RNeasy Mini Kit純化質(zhì)檢合格的總RNA；按照標(biāo)準(zhǔn)流程應(yīng)用Agilent表達(dá)譜芯片配套試劑盒對(duì)純化后的總RNA中的mRNA進(jìn)行放大和標(biāo)記。

1.4 基因芯片的制備 按Gene Expression Hybridization Kit說(shuō)明書(shū)，采用如下比例配置混合液：Cy3標(biāo)記的線性擴(kuò)增的cRNA樣品5 μg，10× Gene Expression Blocking Agent 50 μL，25×Fragmentation Buffer 10 μL,Nuclease-free water 補(bǔ)齊體系總體積至250 μL；60℃水浴孵育混合液30 min，冰上淬冷1 min；加入250 μL 2× Hi-RPM Hybridization Buffer終止RNA裂解，吹打混勻。然后13 000×g離心1 min，將樣品置于冰上并立刻上樣；在載玻片的上樣孔中滴加490 μL樣品，蓋上芯片并將芯片置于雜交盒中，雜交爐中65℃滾動(dòng)雜交17 h。應(yīng)用基因表達(dá)洗滌緩沖液試劑盒(Gene Expression Wash Buffer Kit)對(duì)芯片進(jìn)行洗滌。

1.5 芯片掃描 所用芯片為Agilent Human Gene Expression (8*60K，Design ID:039494)。洗滌后的芯片通過(guò)Agilent Scanner G2505C進(jìn)行掃描。染色通道為Green，掃描分辨率3 μm, 20bit。采用配套軟件Feature Extraction(version 10.7.1.1)讀取原始數(shù)據(jù)，采用Genespring軟件(version 12.5)以及Quantile算法進(jìn)行歸一化處理，得到每個(gè)基因在各樣品中的相對(duì)含量。

1.6 數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用GenBank(http://www.ncbi.nlm. nih. gov/genbank/)全庫(kù)對(duì)基因芯片所得表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行注釋?zhuān)瑢?duì)應(yīng)蛋白產(chǎn)物注釋?xiě)?yīng)用Swissport/UniProt(http://web.expasy.org/docs/swiss-prot_guideline.html)全庫(kù)。Lv-shNOB1-U2OS組和Lv-shCon-U2OS組兩兩配對(duì)做3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。差異基因的篩選采用SPSS 10.0軟件進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)和SAM運(yùn)算。首先對(duì)差異基因進(jìn)行生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)腫瘤基因GO注釋?zhuān)缓髮⒉町惢蛳騁ene Ontology數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.geneontology.org/)的GO條目進(jìn)行映射，從而得到各GO條目的差異基因數(shù)。進(jìn)一步利用SPSS10.0軟件進(jìn)行超幾何檢驗(yàn)，找出差異基因明顯富集的GO條目。同樣，采用與GO富集相似的方法對(duì)通路(pathway)進(jìn)行富集，將差異基因向京都基因與基因組百科全書(shū)(KEGG)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.genome.jp/kegg/)中的通路進(jìn)行映射，再采用超幾何檢驗(yàn)找出差異基因明顯富集的通路條目。

2 結(jié) 果

2.1 NOB1干擾效率檢測(cè) 采用q-PCR法檢測(cè)慢病毒載體干擾效率。在骨肉瘤細(xì)胞系U2OS中，NOB1 shRNA均能有效抑制NOB1的表達(dá)。與Lv-shCon組和Con組比較，干擾效率均大于50%，而Lv-shCon組與Con組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 通過(guò)Lv-shNOB1慢病毒載體轉(zhuǎn)染成功構(gòu)建了Lv-shNOB1-U2OS細(xì)胞株及相應(yīng)的對(duì)照Lv-shCon-U20s細(xì)胞株。

2.2 差異表達(dá)譜分析 在篩選差異基因之前，先進(jìn)行探針過(guò)濾，用于比較的每組樣本中至少有一組100%標(biāo)記為Detected的探針留下進(jìn)行后續(xù)分析。利用差異倍數(shù)Fold change值進(jìn)行篩選，標(biāo)準(zhǔn)為Fold change值≥2.0。本研究對(duì)歸一化后的芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行了差異表達(dá)分析，單熒光芯片的原始數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化處理，轉(zhuǎn)化為log以2為底的對(duì)數(shù)后，在一個(gè)二維直角坐標(biāo)系平面中，繪制散點(diǎn)圖。芯片數(shù)據(jù)的散點(diǎn)圖常用于評(píng)估2組數(shù)據(jù)總體分布集中趨勢(shì)。

從基因芯片代表性熒光雜交信號(hào)散點(diǎn)圖(圖1)可看出，在2個(gè)實(shí)驗(yàn)組間存在大量基因mRNA表達(dá)差異高于2倍，顯示出極大的表達(dá)譜改變。NOB1干擾后共有792個(gè)基因mRNA表達(dá)水平上調(diào)以及1 059個(gè)基因mRNA表達(dá)水平下調(diào)，總共差異變化基因?yàn)? 851個(gè)。

2.3 基因功能的GO分析 本研究設(shè)定超幾何檢驗(yàn)所得P值小于0.05作為差異基因明顯富集的篩選指標(biāo)。分別從細(xì)胞位置(cellular component)、分子功能(molecular function)以及生化過(guò)程(biological_process)3個(gè)一級(jí)條目對(duì)所有差異基因進(jìn)行富集分析。

從細(xì)胞位置條目的富集程度(圖2)來(lái)看，差異基因編碼產(chǎn)物蛋白主要分布于細(xì)胞質(zhì)膜，占56.9%；分布于細(xì)胞外區(qū)域的占39.4%；分布于細(xì)胞外空間占20%；其他所分布區(qū)域按比例由大到小依次為蛋白質(zhì)的細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞外間質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)膜、基底膜、膠原蛋白、核小體、血小板和肌球蛋白。

從分子功能條目的富集程度(圖3)來(lái)看，差異基因編碼產(chǎn)物蛋白主要功能為鈣離子結(jié)合相關(guān)功能，占總差異基因的22%； 其次功能為轉(zhuǎn)運(yùn)子活性，占總差異基因的9.2%； 第3位功能為肌動(dòng)蛋白結(jié)合活性，占總差異基因的8.7%。

從生化過(guò)程條目的富集程度(圖4)來(lái)看，差異基因編碼產(chǎn)物蛋白主要參與過(guò)程為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，占總差異基因的18.7%；其次參與過(guò)程為多種細(xì)胞器生成，占總差異基因的15.6%；第3位過(guò)程為細(xì)胞黏附過(guò)程，占總差異基因的10.2%。

圖2 差異基因的亞細(xì)胞位置分布

圖3 差異基因的分子功能分布

Fig.3 Distribution of molecular function of differential genes

2.4 差異基因通路富集KEGG分析 利用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異基因進(jìn)行Pathway分析，找到富集差異基因的Pathway 條目，尋找不同樣品的差異基因可能與哪些細(xì)胞通路的改變有關(guān)。對(duì)于KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)，滿(mǎn)足條件的差異基因富集條目有上百個(gè)之多，這可能是由于KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)收錄了大量正常代謝和生化途徑相關(guān)通路，這些通路涵蓋基因數(shù)過(guò)多造成的。在此本文作者選擇性的列出富集程度前12的通路。由圖5可知，差異基因在系統(tǒng)性紅斑狼瘡相關(guān)通路(systemic lupus erythematosus)所占總差異基因的比例最大，為24.5%，其次主要分布的通路為細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用通路(cytokine-cytokine receptor interaction)和細(xì)胞的焦點(diǎn)黏連( focal Adhesion)信號(hào)通路，分別占總差異基因的19.4%和16.3%。

圖4 差異基因在生物學(xué)進(jìn)程中的富集情況

Fig.4 Enrichment of differential genes in biological process

圖5 KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中差異基因富集程度通路

Fig.5 Enrichment degree pathways of differential genes in KEGG database

3 討 論

NOB1基因Nob1p(Nin one binding protein)蛋白最早通過(guò)利用酵母雙雜交方法在酵母中鑒定為一種鋅帶蛋白，其在溶酶體的組裝和成熟以及對(duì)于核糖體RNA (ribonsomal RNA, rRNA)的形成過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[11-12]。NOB1是一個(gè)與細(xì)胞周期及轉(zhuǎn)錄相關(guān)的基因，雖然關(guān)于NOBl在腫瘤方面的研究還很有限，其在腫瘤中的功能機(jī)制也并未明確，鑒于NOB1在UPP途徑和核糖體合成過(guò)程中的重要作用，NOB1基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用越來(lái)越受到重視[13-15]。

本研究利用mRNA表達(dá)譜芯片對(duì)Lv-shCon-U2OS組和Lv-shNOB1-U2OS組細(xì)胞分別行表達(dá)譜分析，結(jié)果顯示：NOB1干擾后共有792個(gè)基因mRNA表達(dá)水平上調(diào)，1 059個(gè)基因mRNA表達(dá)水平下調(diào)，總共差異變化基因?yàn)? 851個(gè)。上調(diào)基因數(shù)和下調(diào)基因數(shù)相仿，整體差異基因數(shù)較多，說(shuō)明NOB1干擾后影響的表達(dá)譜范圍較廣，預(yù)示NOB1在骨肉瘤細(xì)胞中可能具有重要的功能。本研究分別從細(xì)胞位置、分子功能以及生化過(guò)程3個(gè)一級(jí)條目對(duì)所有差異基因進(jìn)行GO分析。細(xì)胞質(zhì)膜是指包圍在細(xì)胞表面的一層極薄的膜，主要由膜脂和膜蛋白所組成。質(zhì)膜的基本作用是維護(hù)細(xì)胞內(nèi)微環(huán)境的相對(duì)穩(wěn)定，并參與同外界環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)交換、能量和信息傳遞。另外，細(xì)胞質(zhì)膜在腫瘤細(xì)胞的生存、生長(zhǎng)、分裂和分化中起重要作用。細(xì)胞受體能與細(xì)胞外專(zhuān)一信號(hào)分子(配體)結(jié)合引起細(xì)胞反應(yīng)的蛋白質(zhì)，可分為細(xì)胞表面受體和細(xì)胞內(nèi)受體。受體與配體結(jié)合即發(fā)生分子構(gòu)象變化，從而引起細(xì)胞反應(yīng)，如介導(dǎo)細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞間黏合和細(xì)胞胞吞等細(xì)胞過(guò)程[16]。細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是指細(xì)胞外因子通過(guò)與受體(膜受體或核受體)結(jié)合，引發(fā)細(xì)胞內(nèi)的一系列生物化學(xué)反應(yīng)以及蛋白間相互作用，直至細(xì)胞生理反應(yīng)所需基因開(kāi)始表達(dá)、各種生物學(xué)效應(yīng)形成的過(guò)程。細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是一個(gè)十分復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，對(duì)腫瘤細(xì)胞的各個(gè)方面都有極其重要的影響[17]。

本研究利用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異基因進(jìn)行Pathway分析，結(jié)果顯示：差異基因在系統(tǒng)性紅斑狼瘡相關(guān)通路所占總差異基因的比例最大；其次主要分布的通路為細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用通路和細(xì)胞的焦點(diǎn)粘連信號(hào)通路。 其中，細(xì)胞的許多重要功能均由細(xì)胞因子介導(dǎo)，細(xì)胞因子通過(guò)特定的細(xì)胞表面受體激活相關(guān)信號(hào)通路，并在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用以協(xié)調(diào)生物反應(yīng)，其中比較熱門(mén)的相關(guān)通路有JAK/STAT通路(Janus kinase/signal transducer and activator of transcription)[18-19]、MAPK通路(mitogen-activated protein kinases)[20]和核因子κB(NF-κB)信號(hào)通路等。JAK/STAT通路、MAPK通路以及NF-κB信號(hào)通路作為應(yīng)激反應(yīng)通路，對(duì)胞內(nèi)或胞外的多種刺激做出反應(yīng)，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)增殖、分化、凋亡以及炎癥反應(yīng)等多種重要生物學(xué)過(guò)程的發(fā)生[21-22]。

綜上所述，本研究闡明了NOB1在骨肉瘤中的重要作用，提示NOB1可能參與骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移過(guò)程。本研究為骨肉瘤的基因靶向治療提供了新的具有潛力的治療靶點(diǎn)。