鄒衛(wèi)玲, 馮廣達(dá),, 李華平, 朱紅惠*

1.廣東省微生物研究所, 省部共建華南應(yīng)用微生物國家重點(diǎn)實驗室; 廣東省微生物菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實驗室; 廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實驗室, 廣州 510070;2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 廣州 510642

金屬尾礦中常含有大量的金屬元素，長期堆放和風(fēng)化作用使其中的重金屬不斷釋放，對周圍環(huán)境造成了嚴(yán)重的污染，也對人們的健康構(gòu)成了極大的威脅，但重金屬污染的治理和修復(fù)面臨著諸多困難，如效率低、耗時長、二次污染等。研究表明，利用微生物的吸附[1～3]、礦化[4,5]、強(qiáng)化植物富集[6～9]等作用修復(fù)重金屬污染具有廣闊的應(yīng)用前景[10]。因此，對于這類微生物資源的發(fā)掘與保護(hù)能夠為提高重金屬污染的修復(fù)效率起到重要的基礎(chǔ)支撐作用。目前，相關(guān)功能的微生物資源主要分離自受污染的礦區(qū)土壤[11～13]，而對質(zhì)地堅硬的廢棄礦石及礦砂則關(guān)注較少。廢棄礦石和礦砂中重金屬含量高，營養(yǎng)十分貧瘠，在理化性狀上與土壤存在著較大差異，而正是這種極端環(huán)境中可能蘊(yùn)藏著種類豐富的微生物新資源。為此，本研究采用平板稀釋涂布法對采自廣東省梅州市梅縣的廢棄鉛鋅礦石和贛南鎢礦砂中的可培養(yǎng)細(xì)菌進(jìn)行分離培養(yǎng)和多樣性分析，以期為金屬尾礦中微生物新資源的深入挖掘提供參考。

1 材料和方法

1.1 供試材料

廢棄鉛鋅礦石和鎢礦砂分別采自廣東省梅州市梅縣某廢棄鉛鋅礦區(qū)和贛南某鎢礦區(qū)，其理化性質(zhì)如表1所示。

表1 供試樣品的理化性狀Table 1 Physicochemical properties of the two samples.

1.2 主要試劑

①R2A培養(yǎng)基[14]：酵母提取物0.5 g，蛋白胨0.5 g，酸水解干酪素0.5 g，葡萄糖0.5 g，可溶性淀粉0.5 g，K2HPO40.3 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，丙酮酸鈉0.3 g，瓊脂粉20 g，雙蒸水1.0 L，pH 7.0～7.4；②無磷R2A培養(yǎng)基：去除R2A培養(yǎng)基成分中的K2HPO4，其他成分保持不變；③無磷R2A+Cd2+培養(yǎng)基：向培養(yǎng)基②中添加CdCl2至Cd2+終濃度為2.0 mmol/L。

1.3 分離純化

分別取10 g粉碎混勻的廢棄鉛鋅礦石和鎢礦砂加入到90 mL無菌雙蒸水中，140 r/min搖床25℃振蕩過夜。用無菌水將菌懸液以10倍梯度逐級稀釋，取不同稀釋梯度的菌懸液分別涂布于R2A、無磷R2A培養(yǎng)基、無磷R2A+Cd2+培養(yǎng)基上，于30℃培養(yǎng)2周。隨后挑取不同形態(tài)的單菌落進(jìn)行進(jìn)一步純化培養(yǎng)，并制成甘油濃度為25%(V/V)的甘油菌種，于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 16S rRNA基因PCR擴(kuò)增

取適量菌液于12 000 r/min離心3 min后收集菌體，用1 mL無菌雙蒸水將菌體渦旋均勻，12 000 r/min離心3 min后棄上清。再加入200 μL的無菌水重懸菌體，渦旋均勻后用液氮冷凍，隨后在99℃的固體加熱器保持5 min，渦旋30 s，冷凍和加熱過程重復(fù)2次。最后8 000 r/min離心5 min，取上清液2 μL為模板。采用細(xì)菌通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)進(jìn)行16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增[15]。反應(yīng)體系：dNTP(10 mmol/L)0.5 μL，引物(10 μmol/L)各0.5 μL,10×Buffer 2.5 μL，Taq酶(5 U/μL)0.25 μL，模板2 μL，補(bǔ)充ddH2O至25 μL。擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火40 s，72℃延伸1.5 min，共30個循環(huán)；72℃延伸15 min。將PCR產(chǎn)物交至上海英駿生物技術(shù)公司測序。

1.5 系統(tǒng)進(jìn)化分析

將菌株的16S rRNA基因序列用生物學(xué)軟件MAFFT和PHYLIP進(jìn)行預(yù)處理，隨后采用軟件Mothur以3%的序列差異作為操作分類單元(operational taxonomic unit, OTU)的臨界值對序列進(jìn)行分析[17]。每個OTU中隨機(jī)選取1株菌的16S rRNA基因序列作為代表上傳至GenBank，獲取相應(yīng)的登錄號。再在GenBank中選取與之相似度較大的同源模式種序列，采用軟件MEGA 5.0以Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，計算模型選擇Kimura 2，Bootstrap值設(shè)為1 000次。

1.6 生物多樣性分析

定義16S rRNA序列同源性大于97%為同一個OTU，采用Mothur計算不同樣品中可培養(yǎng)細(xì)菌的多樣性，包括Simpson多樣性指數(shù)(D)，Shannon-Wiener多樣性指數(shù)(H′)和Pielou均勻度指數(shù)(J′)。

計算公式：

Pi表示第i個OTU中的菌株所占比例，S為OTU總數(shù)，N為菌株總數(shù)，ni表示第i個OTU中的菌株數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 廢棄鉛鋅礦石和鎢礦砂中可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性

從廢棄鉛鋅礦石和鎢礦砂中共分離細(xì)菌152株。其中，98株分離自廢棄鉛鋅礦石，劃分為36個OTU，代表序列的GenBank登錄號：JQ429448～JQ429483；其余54株分離自鎢礦砂，劃分為12個OTU，代表序列的GenBank登錄號：JQ429484～JQ429495。多樣性分析的結(jié)果如表2所示，廢棄鉛鋅礦石中可培養(yǎng)細(xì)菌的Simpson多樣性指數(shù)(D)、Shannon-Wiener多樣性指數(shù)(H′)、Pielou均勻度指數(shù)(J′)分別為0.943、3.182和0.888，在多樣性及均勻度上均大于鎢礦砂，這反映出廢棄鉛鋅礦石中的可培養(yǎng)細(xì)菌資源更為豐富。

表2 樣品中可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性分析Table 2 Diversity analysis of culturable bacteria isolated from different samples.

2.2 可培養(yǎng)細(xì)菌的系統(tǒng)進(jìn)化分析

廢棄鉛鋅礦石中可培養(yǎng)細(xì)菌基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹如圖1所示，菌株涵蓋了5個門(Proteobacteria、Firmicutes、Actinobacteria、Deinococcus-Thermus、Bacteroidetes)，以變形菌門(Proteobacteria)為主，約占分離總菌數(shù)的74%。Proteobacteria中的Alphaproteobacteria分支分布有15個OTU，占分離菌株總數(shù)的34%，主要類群為Sphingomonas和Methylobacterium；Betaproteobacteria分支上分布有5個OTU，占分離菌株總數(shù)的28%，Massilia屬為主要類群；Gammaproteobacteria中分布有6個OTU，占分離菌株總數(shù)的12%，主要類群為Lysobacter和Acinetobacter；Deinococcus-Thermus分支上分布了4個OTU(9PNM-15等)，由12株菌組成，約占分離菌株總數(shù)的12%，均從屬于Deinococcus屬；Actinobacteria分支上分布了3個OTU(1PNM-16等)，涵蓋了5株菌，以Kocuria和Arthrobacter的菌株為主；Firmicutes分支上僅分布了1個OTU，由2株菌組成，為Staphylococcus屬的菌株；Bacteroidetes分支上分布了2個OTU，由3株菌組成，其中9NM-4與HymenobacterelongatusVUG-A112T具有較近的進(jìn)化距離。值得注意的是，9PNM-21與MicroscillamarinaATCC 23134T聚成一簇，但16S rRNA基因序列與已有模式種最大相似度僅為85.5%(表3)，可能表示其為Cytophagaceae科內(nèi)的一個新屬。

鎢礦砂中可培養(yǎng)細(xì)菌基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹如圖2所示，菌株涵蓋了3個門(Proteobacteria、Firmicutes、Actinobacteria)，其中變形菌門(Proteobacteria)為優(yōu)勢類群，約占分離菌株總數(shù)的81%。Alphaproteobacteria分支上分布有5個OTU，由22株菌組成，占分離菌株總數(shù)的37%。Methylobacterium屬為其中的優(yōu)勢類群，涵蓋了3個OTU(20株菌)；其余的2個OTU則分別與Microvirga和Sphingomonas形成穩(wěn)定的分支。Betaproteobacteria分支上共分布了3個OTU(6NM-7等)，包括了21株菌，占分離菌株總數(shù)的39%，其中的優(yōu)勢類群為Massilia和Ralstonia。此外，還發(fā)現(xiàn)了與Herbaspirillum屬親緣關(guān)系較近的菌株；Actinobacteria分支上分布了3個OTU，共9株菌，占分離菌株總數(shù)的17%，分別與Streptomyces、Microbacterium和Curtobacterium形成穩(wěn)定的分支。Firmicutes分支上僅分離到了1個菌株，從屬于Bacillus。綜上所述，廢棄鉛鋅礦石中的可培養(yǎng)細(xì)菌涵蓋了5個門、7個分支，以Massilia、Methylobacterium、Deinococcus和Sphingomonas為主要類群。而鎢礦砂中的可培養(yǎng)細(xì)菌涵蓋了3個門、4個分支，以Methylobacterium、Massilia、Ralstonia和Microbacterium為主要類群。Alphaproteobacteria、Betaproteobacteria、Actinobacteria和Firmicutes 4個分支在2種樣品中均有分布，而Gammaproteobacteria、Deinococcus-Thermus、Bacteroidetes僅在廢棄鉛鋅礦石中分離獲得。2種供試樣品中的可培養(yǎng)細(xì)菌均以變形菌門(Proteobacteria)為主，占比均在70%以上，而在屬水平上分布情況分析發(fā)現(xiàn)Methylobacterium、Massilia、Sphingomonas和Herbaspirillum4個屬的菌株在2種樣品中均有分布，其他屬均分布在不同樣品中，表明2種金屬尾礦樣品中的微生物種群在組成上存在較大差異。

圖1 基于廢棄鉛鋅礦石中可培養(yǎng)細(xì)菌16S rRNA基因序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree of the bacteria isolated from abandoned lead-zinc ore constructed by the Neighbor-Joining method based on the 16S rRNA gene sequences.注：圓括號中為該OTU代表菌株的16S rRNA基因序列登錄號；方括號內(nèi)為該OTU所代表的菌株數(shù)量；分支上的數(shù)值代表自舉值。

圖2 基于鎢礦砂中可培養(yǎng)細(xì)菌16S rRNA基因序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of the bacteria isolated from sands of tungsten mine constructed by the Neighbor-Joining method based on the 16S rRNA gene sequences.注：圓括號中為該OTU代表菌株的16S rRNA基因序列登錄號；方括號中為該OTU所代表的菌株數(shù)量；分支上的數(shù)值代表自舉值。

2.3 廢棄鉛鋅礦石和鎢礦砂中的疑似新分類單元

根據(jù)Kim等[17]的建議將16S rRNA基因序列相似度98.65%作為種間的臨界值，在分離的菌株中共發(fā)現(xiàn)了疑似新分類單元16個，16株菌與已發(fā)表的模式種16S rRNA基因序列最大相似度為85.5%～97.9%。其中，最大相似度為97%～98%、96%～97%的菌株各5株，而最大相似度≤96%的有6株(表3)。僅2個疑似新分類單元(6HR-1和6NM-7)分離自鎢礦砂，其余14個均分離自廢棄鉛鋅礦石，廢棄鉛鋅礦石中新分類單元發(fā)現(xiàn)率高達(dá)14%。目前，采用多相分類學(xué)技術(shù)手段已完成其中8個新物種的鑒定和命名，即Massiliaputida、Sphingomonasspermidinifaciens、Lysobactermobilis、Acinetobacterguangdongensis、Sphingomonasguangdongensis、Sphingomonasgimensis、Sphingo-monasdifficilis、Deinococcusmetalli[18～25]。

表3 疑似新分類單元的16S rRNA基因序列同源性Table 3 16S rRNA gene sequences homology of the 16 potential new taxa.

注：-表示數(shù)據(jù)未發(fā)表。

2.4 不同分離培養(yǎng)基對可培養(yǎng)細(xì)菌類群的影響

不同培養(yǎng)基分離的可培養(yǎng)細(xì)菌在門水平上的分布情況如表4所示，R2A培養(yǎng)基分離的菌株涵蓋了5個門，無磷酸鹽R2A培養(yǎng)基分離的菌株涵蓋了4個門，無磷R2A+Cd2+培養(yǎng)基分離的菌株僅涵蓋了1個門(Proteobacteria)。從菌株在門水平上的分布可知R2A中磷酸鹽的去除對分離的可培養(yǎng)細(xì)菌影響較小。而添加2 mmol/L Cd2+使可培養(yǎng)細(xì)菌的多樣性降低，僅分離到Proteobacteria中3個屬的菌株(Methylobacterium、Ralstonia、Herbaspirillum)，且均為革蘭氏陰性菌，其能夠耐受2 mmol/L Cd2+，是金屬尾礦中的優(yōu)勢種群。

表4 不同培養(yǎng)基分離獲取的細(xì)菌在門水平分布情況Table 4 Bacteria distribution in phyla obtained from different media.

3 討論

廢棄鉛鋅礦石和鎢礦砂具有富含重金屬(如Cd、Pb、Zn等)、質(zhì)地堅硬、有機(jī)質(zhì)和水分含量低、營養(yǎng)相對貧乏等極端環(huán)境的特點(diǎn)，這種極端環(huán)境中可能蘊(yùn)藏著豐富的具有重金屬生物修復(fù)潛力的微生物新資源，了解其可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性有助于從中發(fā)掘新的資源。研究表明，采用貧營養(yǎng)的培養(yǎng)基有助于從貧瘠環(huán)境中分離出種類更多的細(xì)菌[26]。R2A培養(yǎng)基中碳源種類豐富，但含量相對較低，屬于貧營養(yǎng)型培養(yǎng)基，與金屬尾礦營養(yǎng)貧瘠的特征相符，且R2A培養(yǎng)基中含有的丙酮酸鈉具有抗氧化作用，能提高微生物的可培養(yǎng)性[27]。Edenborn和Sexstone[28]的研究表明采用R2A培養(yǎng)基分離土壤中的細(xì)菌，物種豐富度要顯著大于TSA、PIA培養(yǎng)基。因此，本研究采用以R2A為基礎(chǔ)的3種培養(yǎng)基研究了廢棄鉛鋅礦石和鎢礦砂中可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性。

本研究發(fā)現(xiàn)廢棄鉛鋅礦石中可培養(yǎng)細(xì)菌的多樣性和新分類單元分離率均大于鎢礦砂，這可能是由鎢礦砂中的Cd含量較高、營養(yǎng)成分相對貧瘠所致。已有的研究也表明重金屬Cd能降低可培養(yǎng)細(xì)菌對碳源的利用及其生物多樣性[29,30]。2種金屬尾礦中的可培養(yǎng)細(xì)菌均以變形菌門(Proteobacteria)為主，分別占分離菌株總數(shù)的74%和81%，根據(jù)不同門的革蘭氏染色特征可知金屬尾礦中的可培養(yǎng)細(xì)菌主要為革蘭氏陰性菌。本研究還發(fā)現(xiàn)僅Methylobacterium、Massilia、Sphingomonas和Herbaspirillum4個屬在2種金屬尾礦中均有分布，其他屬的菌株均分布在不同的樣品中，表明這2種材料中的可培養(yǎng)細(xì)菌類群組成差異較大，可能與其組成成分及所處環(huán)境條件不同有關(guān)。與本研究結(jié)果相類似，已有的研究也表明Methylobacterium、Massilia、Sphingomonas、Herbaspirillum廣泛分布在受污染的土壤[31]和植物體[32,33]中，在維持生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定方面發(fā)揮著重要的作用。

為了進(jìn)一步了解添加Cd2+對分離的可培養(yǎng)細(xì)菌類群的影響，以及供試材料中重金屬耐受性較強(qiáng)的細(xì)菌類群組成，本研究采用R2A、無磷R2A和無磷R2A+Cd2+培養(yǎng)基對金屬尾礦進(jìn)行了可培養(yǎng)細(xì)菌的分離。由于Cd2+與培養(yǎng)基中的磷酸鹽易反應(yīng)產(chǎn)生沉淀，故設(shè)置了去除K2HPO4的無磷酸鹽R2A培養(yǎng)基作為對照。研究結(jié)果表明，K2HPO4的去除對于樣品中可培養(yǎng)細(xì)菌的分離種類的影響相對較小，可能是由于R2A培養(yǎng)基中的其他營養(yǎng)成分中含有的有機(jī)磷源滿足了細(xì)菌的生長需求。在添加了2 mmol/L Cd2+的無磷培養(yǎng)基中僅分離到Proteobacteria門3個屬的菌株，表明重金屬Cd2+降低了可培養(yǎng)細(xì)菌的多樣性。而湛方棟等[34]的研究結(jié)果也表明1 mmol/L和2 mmol/L的Cd2+能顯著抑制根際土壤微生物的生長。本研究采用的2 mmol/L Cd2+濃度可能超出了2種尾礦樣品中大部分可培養(yǎng)細(xì)菌的耐受能力，僅Methylobacterium、Herbaspirillum和Ralstonia3個屬的菌株對Cd2+表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐受性，均為革蘭氏陰性菌。與本研究結(jié)果相似，付瑾等[35]從江西德興銅礦土壤中分離到了能夠耐受4 mmol/L Cd2+的革蘭氏陰性菌Ralstoniapickettii。Zhang等[36]構(gòu)建了鉛鋅尾礦定植植物根際耐受0.5 mmol/L Cd2+的可培養(yǎng)細(xì)菌16S rRNA基因克隆文庫，分析發(fā)現(xiàn)其中主要類群也為革蘭氏陰性菌。近年來，植物內(nèi)生菌中也發(fā)現(xiàn)了耐受重金屬的Methylobacterium、Herbaspirillum、Ralstonia等屬的菌株，其在增強(qiáng)植物抗逆性、提高植物富集重金屬能力等方面展現(xiàn)了良好的應(yīng)用效果[37, 38]。

研究表明，傳統(tǒng)培養(yǎng)方法能夠培養(yǎng)的微生物不足實際數(shù)量的0.1%[39]，因而，近年來，免培養(yǎng)的高通量測序技術(shù)被廣泛應(yīng)用于微生物多樣性研究中。本研究未采用該方法主要是受限于廢棄鉛鋅礦石和鎢礦砂的總DNA提取存在技術(shù)上的困難。盡管高通量測序技術(shù)能更加全面的反映樣品中微生物的多樣性，但傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法在獲取功能微生物資源方面仍具有不可替代的作用，其優(yōu)勢在于能夠獲取目的菌株，并可在此基礎(chǔ)上開展相關(guān)的生物學(xué)特性和功能的研究。也有研究表明傳統(tǒng)培養(yǎng)法比免培養(yǎng)的分子生物學(xué)技術(shù)得到的生物多樣性結(jié)果能更真實地反映重金屬污染程度[40]。因此，在后續(xù)的研究中應(yīng)注重將傳統(tǒng)培養(yǎng)方法與免培養(yǎng)的分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行有機(jī)結(jié)合，既有助于更加全面客觀地揭示金屬尾礦中的微生物多樣性，又能從中獲取更多新的功能微生物資源。