劉 宇, 張 震, 丁倩雯, 李 解, 魯程瑤, 冉 超, 張洪玲, 張進雄, 周志剛

中國農(nóng)業(yè)科學院飼料研究所, 農(nóng)業(yè)部飼料生物技術重點實驗室, 北京 100081

2016年我國水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量達到5 142萬t，約占全世界水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量的3/5，是世界水產(chǎn)養(yǎng)殖第一大國。隨著我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展和養(yǎng)殖集約化程度的提高，養(yǎng)殖環(huán)境日趨惡化，水產(chǎn)品的質(zhì)量也相應地不斷下降[1]。研究者發(fā)現(xiàn)短鏈脂肪酸(short chain fatty acids, SCFAs)作為腸道菌群在體內(nèi)發(fā)酵不易消化的碳水化合物產(chǎn)生的代謝物質(zhì)，對宿主的營養(yǎng)代謝與免疫抗病有著重要的調(diào)控作用，作為新型飼料添加劑具有廣闊前景。 在哺乳動物及水產(chǎn)動物中主要存在的SCFAs有乙酸、丙酸、丁酸。研究者系統(tǒng)研究了SCFAs對哺乳動物食欲、葡萄糖穩(wěn)態(tài)及胰島素分泌的影響[2,3]，并且認為乙酸鹽是腸道微生物與宿主代謝的耦合點[4]，如Perry等[3]報道乙酸鹽會促進小鼠攝食增加導致增重和胰島素抵抗。但在水產(chǎn)領域對于乙酸鹽等SCFAs的生產(chǎn)研究是相對滯后的。因此，對乙酸鹽等SCFAs對水產(chǎn)動物的營養(yǎng)代謝調(diào)控進行研究是非常有必要的。

魚類養(yǎng)殖經(jīng)濟效益的實現(xiàn)主要依賴于魚類的生長，魚類的生長與其攝食量密切相關，而食欲是決定動物攝食量的一個重要因素，因此深入了解乙酸鹽等SCFAs對魚類食欲的影響，對促進水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展具有重要意義。研究表明高等動物的攝食行為通過基因調(diào)控，這些基因作用于大腦中的攝食中心，可以分為促進食欲的基因和抑制食欲的基因兩類[5]。例如，促食欲基因有下丘腦泌素(hypocretin neuropeptide，hcrt)、神經(jīng)肽 Y(neuropeptide Y，NPY)、饑餓素(ghrelin)等。抑制食欲基因有促胃液激素釋放肽 (gastrin-releasing peptide，Grp)、 可卡因苯丙胺調(diào)節(jié)轉錄肽(cocaine-and amphetamine-regulated transcript，CART)、黑素皮質(zhì)素受體4(melanocortin 4 receptor，MC4r)等。胰島素是由胰島β細胞受內(nèi)源性或外源性物質(zhì)如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一種蛋白質(zhì)激素，對蛋白質(zhì)及脂質(zhì)代謝有促進合成的作用，因此對調(diào)控胰島素分泌的物質(zhì)進行研究對于營養(yǎng)代謝尤其重要。文獻報道，Glp-1、Nucb2a基因在胰島素分泌通路中起著重要的促進作用[6～8]。而Goat基因對胰島素分泌起著相反的作用[9]。

本研究以斑馬魚作為研究對象，通過 RT-PCR 實驗，對經(jīng)腹腔注射乙酸鈉處理的斑馬魚食欲相關基因的表達水平進行了分析，從而探討了乙酸鈉對斑馬魚食欲的影響。進一步分析腹腔注射乙酸鈉不同時間后不同組織胰島素分泌基因的影響，探討乙酸鈉對斑馬魚胰島素分泌的影響，為乙酸在水產(chǎn)上的應用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

本實驗選用成年斑馬魚，購自北京花鳥市場。所購斑馬魚在長100 cm、寬60 cm、高50 cm、水體體積40 L的玻璃缸中暫養(yǎng)兩周，以消除應激反應，養(yǎng)殖條件控制水溫28℃，水中溶氧>6.0 mg/L，pH 7.0～7.2，氨氮含量<0.5 mg/L，14 h 光照，10 h 黑暗。在暫養(yǎng)期間，每天上午9：00 和下午4：00以商業(yè)飼料正常喂養(yǎng)。

1.2 注射試劑配制

將乙酸鈉溶于生理鹽水，并按如下濃度進行配制：①生理鹽水；②生理鹽水+乙酸鈉(0.4 μmol/g)；③生理鹽水+乙酸鈉(0.8 μmol/g)；④生理鹽水+乙酸鈉(1.2 μmol/g)。

1.3 斑馬魚腹腔注射

實驗開始的前一天，在上午10:00以商業(yè)飼料飼喂斑馬魚。在饑餓24 h后開始腹腔注射實驗。將斑馬魚冰水浴麻醉，斑馬魚失去知覺后用微量進樣器將不同濃度的乙酸鈉注射入斑馬魚腹腔。

1.4 斑馬魚注射后取樣

為統(tǒng)計斑馬魚注射后不同時間點對斑馬魚攝食基因、血糖含量、胰島素含量、胰島素分泌相關基因的變化情況，在斑馬魚注射乙酸鈉2 h、4 h、6 h后冰水浴麻醉斑馬魚，用消毒鑷子取肝、腦、腸組織置于無菌EP管中，放入液氮保存。

1.5 實時定量PCR檢測基因的mRNA水平

取各組斑馬魚肝臟、腦、腸組織進行RNA提取，總RNA提取采用Trizon Reagent提取的方法。反轉為cDNA后以其作為模板進行qPCR 檢測，熒光定量PCR引物如表1所示。反應體系：反轉錄產(chǎn)物(cDNA)2 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，2×SYBR Premix ExTaqTMⅡ 10 μL，RNAase-free水6 μL。實時定量采用兩步PCR擴增法，程序為：95℃ 10 s；95℃ 5 s ，60℃ 30 s，40個循環(huán)。反應結束后對獲得的信號和數(shù)據(jù)進行處理。

1.6 數(shù)據(jù)分析

所有的統(tǒng)計數(shù)據(jù)均來自至少3次以上的獨立實驗，使用軟件Graphpad Prism 5.0或是Microsoft Office Excel 2010進行繪圖。數(shù)據(jù)用“平均值±標準誤”(M ±SE)的形式進行表示。采用t檢驗比較不同組數(shù)據(jù)之間的差異。P<0.05時認為存在統(tǒng)計學顯著性差異，圖中以“*”標記；P<0.01時認為存在統(tǒng)計學極顯著差異，圖中以“**”標記。

表1 斑馬魚引物序列Table 1 Zebrafish primer sequence.

2 結果與分析

2.1 腹腔注射乙酸鈉對斑馬魚促進攝食基因表達量的影響

腹腔注射乙酸鈉2 h、4 h、6 h后取斑馬魚腦組織檢測攝食基因表達水平。結果發(fā)現(xiàn)(圖1)，在腹腔注射0.8 μmol/g乙酸鈉2 h后，npy基因表達水平提高了72.1%(P>0.05),4 h時npy基因表達水平未出現(xiàn)顯著性變化，6 h時乙酸鈉0.8 μmol/g處理組npy基因表達量是對照組的1.6倍(P>0.05)。npy7R基因在2 h時未出現(xiàn)顯著性變化，4 h時0.4 μmol/g和1.2 μmol/g處理組表達量提高了87.2%和206.9%(P>0.05)。6 h時乙酸鈉1.2 μmol/g處理組npy7R表達量具有增加趨勢，其表達水平是對照組的2.8倍。ghre基因表達水平在2 h時未出現(xiàn)顯著性變化，在4 h時1.2 μmol/g處理組表達水平顯著性升高，是對照組的5.95倍(P<0.01)，6 h時1.2 μmol/g乙酸鈉注射組表達水平是對照組的5.16倍(P<0.01)。其他處理組未出現(xiàn)顯著性變化。

圖1 腹腔注射乙酸鈉對攝食基因表達水平的影響Fig.1 Effects of intraperitoneal injection of sodium acetate on the orexigenic gene expression levels.A.腦組織npy基因相對表達量；B.腦組織npy7R基因相對表達量；C.腦組織ghre基因相對表達量。**表示處理組與CK組相比，差異極顯著(P<0.01)。

圖2 腹腔注射乙酸鈉對抑制攝食基因表達水平的影響Fig.2 Effect of intraperitoneal injection of sodium acetate on the anorexigenic gene expression levels.A.腦組織cart基因相對表達量；B.腦組織grpr基因相對表達量；C.腦組織mc4R基因相對表達量

2.2 腹腔注射乙酸鈉對斑馬魚抑制攝食基因表達量的影響

檢測斑馬魚腦組織抑制攝食基因的表達量發(fā)現(xiàn)(圖2)，cart基因表達量在2 h、4 h和6 h時未出現(xiàn)顯著性變化。grpr基因1.2 μmol/g處理組在2 h、4 h和6 h時表達水平都出現(xiàn)下降趨勢，2 h時grpr基因表達量下降了28.3%(P>0.05)，4 h時grpr基因相對表達水平降低了33.8%(P>0.05)，6 h時基因表達水平降低了25.4%(P>0.05)，而其他處理組未出現(xiàn)明顯變化。mc4R基因在2 h和4 h時未出現(xiàn)顯著性變化，在6 h時1.2 μmol/g乙酸鈉注射組mc4R基因表達水平提高了61.2%(P>0.05)。

2.3 腹腔注射乙酸鈉對斑馬魚胰島素分泌基因表達量的影響

2.3.1肝臟胰島素分泌基因表達量的變化 如圖3所示，檢測斑馬魚肝臟組織胰島素分泌基因的表達水平，glp-1基因在腹腔注射6 h后表達量顯著性上升，表達水平是對照組的2.1倍。nucb2a基因表達水平在1.2 μmol/g乙酸鈉腹腔注射6 h后出現(xiàn)顯著性上升，其表達水平提高了2.3倍(P<0.05)。1.2 μmol/g乙酸鈉注射組goat基因表達水平有提升趨勢，其表達量提高了6.5倍。4 h時不同濃度處理組未出現(xiàn)顯著性變化。6 h時0.4 μmol/g和1.2 μmol/g注射組goat基因表達水平顯著性提升，分別是對照組的7.6倍和13.1倍(P<0.05，P<0.01)。

2.3.2腸道胰島素分泌基因表達量的變化 檢測斑馬魚腸道胰島素分泌基因表達量發(fā)現(xiàn)(圖4)，促進胰島素分泌基因glp-1在2 h時不同濃度處理組均顯著性提高，其中，0.4 μmol/g、0.8 μmol/g處理組glp-1表達量提高了3.6倍和2.6倍(P<0.05，P<0.05)，1.2 μmol/g乙酸鈉注射組glp-1表達量是對照組的3.5倍(P<0.05)。4 h時glp-1表達水平未出現(xiàn)顯著變化，6 h時1.2 μmol/g處理組表達量有升高趨勢，提高了1.67倍(P>0.05)。nucb2a基因表達量在2 h時不同濃度處理組均出現(xiàn)不同程度的提高，0.4 μmol/g處理組表達水平提高了10.7倍(P>0.05)，0.8 μmol/g處理組表達水平提高了14.7倍(P>0.05),1.2 μmol/g處理組表達量是對照組的4.7倍(P>0.05)。乙酸鈉腹腔注射4 h時nucb2a基因表達水平出現(xiàn)上升趨勢，0.4 μmol/g、0.8 μmol/g和1.2 μmol/g分別提高了3.9倍、2.7倍和4.9倍(P>0.05)。6 h時1.2 μmol/g注射組基因表達水平提高了2.6倍(P<0.05)。goat基因腹腔注射2 h時0.4 μmol/g注射組表達量上升，其基因表達量是對照組的7.6倍(P<0.05)。0.8 μmol/g注射組表達量是對照組的20.9倍(P>0.05)。4 h時各處理組未出現(xiàn)顯著性變化。腹腔注射6 h時1.2 μmol/g處理組goat表達量提高了17.4倍(P>0.05)。

圖3 腹腔注射乙酸鈉肝組織胰島素分泌基因表達量的變化Fig.3 Insulin secretory gene expression in liver tissue after intraperitoneal injection of sodium acetate.A.肝組織glp-1基因相對表達量；B.肝組織nucb2a基因相對表達量；C.肝組織goat基因相對表達量。*和**分別表示處理組與CK組相比，在P<0.05和P<0.01水平上差異顯著。

圖4 腹腔注射乙酸鈉腸組織胰島素分泌基因表達量Fig.4 Insulin secretory gene expression in intestine tissue after intraperitoneal injection of sodium acetate.A.腸組織glp-1基因相對表達量；B.腸組織nucb2a基因相對表達量；C.腸組織goat基因相對表達量。*表示處理組與CK組相比差異顯著(P<0.05)。

3 討論

乙酸鈉經(jīng)腹腔注射入機體后，在4 h后即可提高斑馬魚促進食欲基因的表達量，對抑制攝食基因表達量并無顯著性影響。同時，乙酸鈉能夠提高斑馬魚肝臟組織和腸組織促進胰島素分泌基因的表達。并且腹腔注射乙酸鈉2 h后即可對斑馬魚腸組織胰島素分泌基因發(fā)揮調(diào)控作用，而斑馬魚肝臟組織則在腹腔注射6 h后對斑馬魚促進胰島素分泌基因表達水平有著顯著性的提高。goat基因表達量的升高可能是機體對于促進胰島素分泌基因表達水平的提高作出的反饋調(diào)節(jié)。同樣地，Perry 等[3]在小鼠中證實乙酸鹽會促進小鼠攝食增加導致增重和胰島素抵抗。而相反的是Den等[10]添加5%(w/w)乙酸鈉到高脂飼料中，飼喂小鼠12周，動物表現(xiàn)體重增加減少和改善的胰島素敏感性，沒有改變攝食量和身體活動。Lu 等[11]證實用添加乙酸5%(w/w)的高脂飼料飼喂小鼠12周，會抑制體重增加，改善葡萄糖穩(wěn)態(tài)，降低胰島素濃度。爭議結果的出現(xiàn)可能與實驗動物種類、實驗環(huán)境和實驗條件等相關，人類實驗的證據(jù)是有限的，需要我們進一步的研究。

乙酸鹽在水產(chǎn)動物中的研究主要集中于對水產(chǎn)動物的表型研究，SCFAs對水產(chǎn)動物的營養(yǎng)代謝調(diào)控作用研究較少。早前Ring?[12]報道1 g/kg的乙酸鈉作為飼料添加劑可以提高貝爾湖紅點鮭(Salvelinusalpinus)的增重率，并推測是由于飼料消化率的提高引起的。daSilva等[13]表明乙酸鈉對南美白對蝦的弧菌屬有較高的抑制能力，有利于水產(chǎn)動物的生長表現(xiàn)。隨著研究的發(fā)展，我們發(fā)現(xiàn)乙酸鹽對于水產(chǎn)動物生產(chǎn)表現(xiàn)的提高可能是由于乙酸鹽對于水產(chǎn)動物食欲及胰島素分泌的重要調(diào)節(jié)作用引起的，具體機理有待于進一步研究。