張永濤 高淵濤 李 宵 付明陽 田 峰 李鵬飛 劉 芳 王春芳△

(1 山西醫(yī)科大學實驗動物中心, 實驗動物與人類疾病動物模型山西省重點實驗室, 太原 030001; 2 南昌大學瑪麗女王學院, 南昌 330031)

脊髓損傷(spinal cord injury, SCI)是常見的一種創(chuàng)傷性疾病,有多種原因引起[1],近20年來發(fā)病率明顯增高[2]。由其引起的嚴重殘疾和醫(yī)療費用已成為患者及其家庭和社會的沉重負擔[3-4]。目前,治療脊髓損傷的措施主要有手術、藥物以及細胞移植治療等,神經(jīng)干細胞治療是最有前景的治療方案[5],其可在損傷部位存活增殖并分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞,且誘導宿主5-羥色胺能纖維的軸突再生,從而促進運動功能修復[6-8]。但神經(jīng)干細胞的來源、免疫排斥以及倫理問題等一直制約著其臨床應用[9-10]。如何誘導內(nèi)源性神經(jīng)干細胞活化、增殖及定向分化,已成為今后研究的趨勢。神經(jīng)干細胞能否很好地促進脊髓損傷功能修復,主要取決于神經(jīng)干細胞在損傷部位的生長、增殖以及向神經(jīng)元的分化。microRNA是一種小分子非編碼RNA,近期研究報道其廣泛表達于中樞神經(jīng)系統(tǒng)[11],與靶基因的mRNA特異性相結(jié)合,在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控著神經(jīng)干細胞的生長、增殖、分化和凋亡等多種生物學功能。其中miR-126對神經(jīng)干細胞的生長增殖、分化的調(diào)節(jié)作用尤其重要[12-13],但其具體作用機制尚不清楚。有報道m(xù)iR-126可以通過綁定到同源框來調(diào)控HOXA9,而HOXA9又是脊髓運動神經(jīng)元的發(fā)育過程中的關鍵基因[15]。因此,本研究探討miR-126通過調(diào)節(jié)HOXA9的表達發(fā)揮對神經(jīng)干細胞的調(diào)控作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級成年FVB小鼠42只,體質(zhì)量25～30g,由山西醫(yī)科大學實驗動物中心提供,恒溫恒濕,晝夜各半,自由飲食。

1.2 主要試劑

H-E染色試劑盒(Solarbio,中國);尼氏染色試劑盒(Beyotime，中國);microRNA Isolation Kit (Life Technologies,美國); Prime-Script RT試劑盒(TaKaRa,Tokyo,日本);SYBR?Select Master Mix(Applied Biosystems,美國);增強型RIPA裂解液(Boster,中國);nestin、HOXA9兔抗鼠多克隆抗體、GAPDH兔抗鼠多克隆抗體、羊抗兔抗體(HRP)(Abcam,美國)。

1.3 模型制作

將小鼠隨機分為實驗組(36只)和對照組(6只)。實驗組吸入麻醉成功后固定于手術臺,應用Impactor M-Ⅲ spinal cord contusion system(W. M Keck Center for Collaborative Neuroscience Rutgers, the State Univesity of New Jersey, USA),采用Allen法制作第10胸椎(T10)脊髓損傷模型(質(zhì)量5g,垂直高度25mm)。術后常規(guī)逐層縫合。術后3d,肌注青霉素G(4000u),預防感染。每天輔助排尿,直至完全恢復自主排尿。

1.4 運動功能評分

1.5 H-E染色,尼氏染色

BMS評分后,0.9%生理鹽水心灌注,然后4%多聚甲醛灌注小鼠。隨后,解剖出脊髓損傷部位,置于4%多聚甲醛內(nèi)固定24h,常規(guī)梯度乙醇脫水,二甲苯透明,石蠟固定包埋備用;Leica切片機(RM2245 USA)每張5μm連續(xù)切片,60℃烘箱2h烘干備用。常規(guī)脫蠟至水,按H-E染色、尼氏染色試劑盒說明書進行染色后,梯度乙醇脫水、二甲苯透明,中性樹脂封片后鏡下觀察并拍片記錄。

1.6 RT-PCR

提取同一節(jié)段的脊髓,應用microRNA Isolation Kit提取microRNA和總RNA。Taqman microRNA Assays試劑盒進行miR-126實時定量PCR(RT-PCR)檢測。miR-U6作為內(nèi)參。為了測定mRNA的表達,使用Prime-Script RT試劑盒在PCR儀(Eppendorf, USA)上42℃ 60min,70℃ 15min進行逆轉(zhuǎn)錄(RT)反應,合成第一鏈。然后使用SYBR?Select Master Mix,在7300 Real Time PCR System (Applied Biosystems, USA)進行95℃ 10min預變性。95℃ 15s和60℃ 1min,40個循環(huán)。最后采用delta-delta CT方法定量基因表達變化,以GAPDH作內(nèi)參,引物由華大基因(Beijing Genomics Institute, 中國)設計和合成。

1.7 免疫印跡檢測

取脊髓組織樣本加入增強型RIPA裂解液和1%PMSF,冰上研碎,4℃孵育4h后,12.0×103r/min,4℃ 下離心20min,取上清,經(jīng)BCA蛋白濃度測定后-80℃保存?zhèn)溆?。應用等質(zhì)量樣本30μg進行凝膠電泳,依照marker條帶切下目的條帶,轉(zhuǎn)膜15min,5%脫脂牛奶(伊利,中國)室溫下封閉非特異性條帶2h,一抗(1∶1000)4℃孵育過夜,TBS-T清洗后,二抗(1∶2000)室溫下避光孵育2h,TBS-T清洗后拍片保存,然后使用Quantity One 4.6.2 software (Bio-Rad, USA)進行量化分析。

1.8 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 脊髓損傷不同時期運動功能評分

為了檢測小鼠脊髓損傷后運動功能的修復,應用BMS評分評估了小鼠后肢運動功能,術前實驗組與對照組BMS評分均為9分,實驗組術后在1、3、7、14、21、28d BMS評分(表1)顯示,1、3d時運動功能完全喪失,7d時運動功能出現(xiàn)恢復跡象,與第1、3天相比,14、21d恢復較為顯著,第28天時趨于平穩(wěn),與21d時相比差異無統(tǒng)計學意義。

表1 對照組與實驗組不同時期的BMS評分

**P<0.01vs1d

2.2 脊髓損傷后不同時期損傷情況及尼氏體的數(shù)量變化

為了檢測脊髓損傷后不同時期脊髓損傷部位病理學的變化,分別在不同時期取相同部位組織,石蠟包埋切片后進行H-E染色、尼氏染色。與對照組(圖1A1、A2)相比,損傷后第1天時(圖1B1、B2)可見局部正常組織結(jié)構(gòu)形態(tài)完全喪失,細胞排列次序紊亂,出現(xiàn)大量的核碎裂,核濃縮,尼氏體大量減少,其間大量血細胞及炎性細胞積聚。3d時(圖1C1、C2)進一步加劇,尼氏體基本消失,第7天(圖1D1、D2)血細胞及滲出的炎性細胞被吸收,疏松紊亂的組織間隙被大量的組織間質(zhì)充填。在不規(guī)則的組織中可見少量尼氏體出現(xiàn)。第14天(圖1E1、E2)水腫消退,并可見纖維疤痕及空洞形成。21d后(圖1F1、G1、F2、G2)纖維組織進一步增多,其間可見散在的尼氏體。

2.3 脊髓損傷后不同時期nestin的表達

為觀察神經(jīng)干細胞在脊髓損傷后不同時期的變化,在不同時期對脊髓損傷部位神經(jīng)干細胞的標記物nestin mRNA及其相應蛋白進行檢測。結(jié)果顯示，在脊髓損傷后早期Nestin mRNA的表達量(圖2A)明顯下降,而后逐漸升高,在21d(圖2A)時達到高峰后再次下降。Nestin蛋白(圖2B)的表達量具有相同趨勢。

圖2 Nestin mRNA (A)及其相應蛋白(B)表達的變化

2.4 脊髓損傷后miR-126的表達

為觀察脊髓損傷后不同時期miR-126的表達變化情況,在不同時期脊髓損傷部位進行RT-PCR檢測,所得數(shù)據(jù)顯示,脊髓損傷后miR-126總體表達量下降。早期(1～7d)下降最為明顯,而后逐漸升高,在21d時達到高峰,表達量高于對照組,而后再次下降(圖3)。

圖3 對照組與實驗組不同時期miR-126的相對表達量

2.5 脊髓損傷后HOXA9的表達

為了探討脊髓損傷后miR-126是通過何種機制來調(diào)節(jié)神經(jīng)干細胞的分化,從而促進脊髓功能修復。在不同時期對脊髓損傷部位miR-126的下游靶基因HOXA9進行RT-PCR、免疫印跡檢測,所得數(shù)據(jù)顯示,脊髓損傷后HOXA9表達量早期與對照組相比明顯升高,而后逐漸下降,在21d下降最為明顯(圖4)。

圖4 對照組與實驗組不同時期HOXA9 mRNA (A)及蛋白質(zhì)(B)的相對表達量

圖1 對照組與實驗組不同時期脊髓損傷部位的H-E染色(A1～G1)和尼氏染色(A2～G2),標尺=100μmFig 1 H-E staining(A1-G1) and Nissl s staining (A2-G2) of spinal cord injury at different periods in the control and the experimental groups. Bar=100μmA: Control group; B: SCI 1d; C: SCI 3d; D: SCI 7d; E: SCI 14d; F: SCI 21d; G: SCI 28d

2.6 miR-126、HOXA9、nestin、尼氏體的相關性分析

結(jié)果(表2)顯示miR-126與nestin、尼氏體呈正相關,與HOXA9呈負相關。HOXA9與miR-126、nestin、尼氏體呈負相關。

表2 miR-126、HOXA9、nestin、尼氏體相關性分析(r)

*P<0.05,**P<0.01

3 討論

脊髓損傷是一種嚴重的創(chuàng)傷性疾病,多因創(chuàng)傷導致局部神經(jīng)組織、細胞變性壞死以及脊髓神經(jīng)連續(xù)中斷,從而引起損傷平面以下感覺、運動及自主神經(jīng)功能障礙。神經(jīng)元的受損部位是引起脊髓功能障礙的主要因素,如何促進受損部位神經(jīng)元的再生,已成為近期研究的熱點。目前,在治療脊髓損傷的眾多方案中,神經(jīng)干細胞治療是最有前途的治療方案之一[5]。神經(jīng)干細胞具有自我更新、增殖、遷移、定向分化的潛能,其分化的神經(jīng)元可替代壞死丟失的神經(jīng)元并與周圍正常神經(jīng)元形成新的突觸,重建傳導通路[8]。神經(jīng)干細胞治療主要有2種方式： (1) 應用外源性神經(jīng)干細胞進行移植;(2) 誘導內(nèi)源性神經(jīng)干細胞增殖、分化。由于外源性神經(jīng)干細胞的來源、免疫排斥以及倫理等問題制約其臨床應用[9-10],因此,如何誘導內(nèi)源性神經(jīng)干細胞增殖、分化成為近期研究的熱點。

miR-126是眾多microRNAs中的一種類型,其在血管內(nèi)皮細胞中高度富聚[17],能與靶基因的mRNA特異性結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后發(fā)揮調(diào)控作用;作為一種調(diào)控基因,參與細胞的生長增殖、分化、凋亡等多種生物進程的調(diào)控[18]。以往的研究表明miR-126在維持血管的完整性方面發(fā)揮著重要的作用,并且在胚胎發(fā)育過程中及損傷后促進血管生成[19-21]。近期Hu等[22]報道在脊髓損傷后上調(diào)miR-126表達,其通過調(diào)控SPRED1、PIK3R2和VCAM1 3個靶基因的mRNA和蛋白質(zhì)的表達,促進血管新生和減弱炎癥損傷,促進脊髓功能修復。Zhang等[13]在體外神經(jīng)干細胞培養(yǎng)過程中顯示miR-126能夠促進神經(jīng)干細胞生長增殖并抑制其凋亡。易松敏等[23]報道將脊髓源性神經(jīng)干細胞誘導分化為膽堿能神經(jīng)元后,定量檢測分化前、后miR-126的表達變化,結(jié)果顯示在分化后的膽堿能神經(jīng)元中miR-126的表達明顯高于未分化的神經(jīng)干細胞。Wei等[24]在神經(jīng)干細胞與運動神經(jīng)元miRNA差異表達分析中也證實miR-126在運動性神經(jīng)元中的表達水平顯著高于神經(jīng)干細胞。這表明miR-126在神經(jīng)干細胞生長增殖及分化過程中發(fā)揮著重要調(diào)控作用。而在體內(nèi)miR-126是否也同樣具有促進神經(jīng)干細胞生長增殖和分化的作用,尚未見報道。本實驗結(jié)果顯示，脊髓損傷急性期miR-126表達量和神經(jīng)干細胞數(shù)量明顯下降,同時尼氏體也大幅度減少甚至消失；進入亞急性期后,隨著miR-126 表達量升高,神經(jīng)干細胞及尼氏體也逐漸增多。因此,推測在體內(nèi)miR-126對神經(jīng)干細胞的生長增殖和分化也具有一定的調(diào)節(jié)作用。

雖然miR-126在神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元生長增殖、分化過程中具有重要調(diào)控作用,但其具體作用機制尚未見詳細報道。Wei等[24]在3種靶基因預測程序中檢測到HOXA9是miR-126的下游靶基因,miR-126對其有負向調(diào)控作用。因此,本次實驗又對HOXA9進行了檢測,結(jié)果顯示在miR-126表達量較低時HOXA9的表達量顯著升高,而尼氏體數(shù)量減少；隨著miR-126的逐漸升高,HOXA9出現(xiàn)下降趨勢,同時尼氏體數(shù)量也逐漸增加,運動功能也得到一定的恢復。經(jīng)統(tǒng)計學分析顯示，HOXA9表達與miR-126表達及尼氏體數(shù)量呈負相關,miR-126與神經(jīng)干細胞和尼氏體數(shù)量呈正相關。據(jù)報道,人類的HOX基因共有39個,分布在4個染色體組。通過HOX基因同源盒序列的比較顯示,只有HOXA9包含miR-126的結(jié)合位點[25]。Shen等[26]報道m(xù)iR-126在HOXA9同源盒上的靶點高度保守,miR-126可以通過降解HOXA mRNA來下調(diào)HOXA9蛋白水平。而Hox蛋白又是脊髓運動神經(jīng)元定性和組成的重要決定因素[27],因此,推測miR-126可能在促進神經(jīng)干細胞生長增殖的同時也可通過負向調(diào)控HOXA9表達,提高神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元分化的比例,進而促進受損脊髓神經(jīng)功能的修復。一種基因可以調(diào)控多種細胞的生長增殖、分化,同時一種細胞也受多種基因調(diào)控。在本次實驗中僅觀察到miR-126在治療脊髓損傷過程中,可能在促進神經(jīng)干細胞生長增殖的同時，通過負向調(diào)節(jié)HOXA9來提高其向神經(jīng)元的分化,但這只是其中的一小部分,在此過程中也可能有其他因素的共同參與。