劉 剛, 伍佩珂, 蔣小妹, 汪淑芳, 張曉喻, 楊秋萍, 李學(xué)理, 吳鳳蘭

(1. 四川師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 四川 成都 610101；2. 四川師范大學(xué) 食品功能及加工應(yīng)用研究所, 四川 成都 610101)

桂花(OsmanthusfragransLour.)是木犀科木犀屬的小喬木[1]，原產(chǎn)我國(guó)西南部，主要分布于廣西、湖南、貴州及福建等地區(qū)[2].中國(guó)南嶺以北到秦嶺以南的中亞熱帶和北亞熱帶(北緯24°～33°)，是桂花集中分布和栽培的地區(qū)[3].桂花花朵的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、民間習(xí)用歷史久遠(yuǎn)，早在漢朝就已廣泛應(yīng)用于食品、香料、酒、茶等行業(yè)，研究也較多[4-5].桂花的果實(shí)可入藥，有化痰、生津、暖胃、平肝的功效，其枝葉及根可煎汁敷患處，具有活筋骨、止疼痛的功效[6].有研究表明，桂花果皮作為未充分利用的副產(chǎn)物,含有多種功效成分[7-8].如蒽醌類(lèi)化合物，其具有抑菌、抗腫瘤、止血等作用,含有的有機(jī)酸具有抗菌、利膽、升白等作用,其黃酮類(lèi)化合物有抗菌、抗病毒、解痙攣等作用,桂花果皮中的黑色素還具有抗氧化活性[9].研究桂花果皮提取物的抗菌活性，具有重要意義.

金黃色葡萄球菌S.aureus是重要的條件致病菌[10]，屬革蘭氏陽(yáng)性菌，它不僅易引發(fā)許多嚴(yán)重感染，而且還可產(chǎn)生具有較強(qiáng)細(xì)胞毒性的腸毒素.大腸桿菌E.coli是人類(lèi)及各類(lèi)溫血?jiǎng)游锬c道中的正常寄居菌，屬于革蘭氏陰性菌.大腸桿菌是國(guó)際上公認(rèn)的衛(wèi)生監(jiān)測(cè)指示菌[11]，如果食品、飲水中檢測(cè)出該菌，就意味著該食物可能直接或間接受到了糞便的污染[12].本實(shí)驗(yàn)研究以金黃色葡萄球菌、大腸桿菌為目標(biāo)檢測(cè)微生物，研究桂花果皮醇提物的抑菌活性，并進(jìn)一步研究桂花果皮醇提物清除DPPH·和ABTS·的能力，從而評(píng)價(jià)其抗氧化活性.近年來(lái)，對(duì)桂花油脂類(lèi)功能的研究較多[13-14]，但是，對(duì)桂花果皮醇提物的抑菌及抗氧化活性，目前尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道.

1 材料和方法

1.1材料與文獻(xiàn)[1]對(duì)照，在四川師范大學(xué)成龍校區(qū)采集的植物材料，鑒定為桂花(O.fragrans)，采集其果實(shí)后，去雜清洗，分離出種子與果皮.果皮置60 ℃干燥，粉碎，過(guò)20～40目篩，備用.桂花果皮醇提物的制備：稱(chēng)取桂花果皮25.00 g，按1∶20比例加入體積分?jǐn)?shù)70%乙醇，60 ℃水浴回流提取1 h，重復(fù)2次，過(guò)濾，合并過(guò)濾液，濃縮至50 mL(以生藥量計(jì)500 mg/mL)，冷藏備用.

1.2測(cè)試菌種金黃色葡萄球菌、大腸桿菌均由四川師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供.分別取出大腸桿菌、金黃色葡萄球菌各0.1 mL，接種到20 mL牛肉膏蛋白胨瓊脂固體培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，挑選生長(zhǎng)健壯的菌落，再接種到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h活化菌種，備用.參照文獻(xiàn) [15]的方法，制備菌懸液：分別取活化菌種各0.1 mL，置于20 mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h.紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)625 nm處測(cè)定OD值，加無(wú)菌的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)菌懸液體積使其OD值在0.08～0.13，此時(shí)每毫升菌懸液的活菌數(shù)(CFU，培養(yǎng)單位)即為108CFU/mL.測(cè)定時(shí)，再加適量無(wú)菌牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，使菌懸液的活菌數(shù)稀釋到105CFU/mL.

1.3儀器R-1005型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海予華儀器設(shè)備有限公司；SHB-B95型循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；HH.W21型恒溫水浴鍋，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；LDZX-50KB型立體壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；ESJ205-4型電子分析天平，沈陽(yáng)龍騰電子稱(chēng)量?jī)x器有限公司；DZF-6050型真空干燥箱、DHP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-2F型超凈工作臺(tái)，蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；DHG-9240型電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；UV-2600型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本島津科學(xué)儀器公司.

1.4試劑牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(杭州微生物試劑有限公司),乙醇、甲醇、DPPH、ABTS(成都市長(zhǎng)征化玻有限公司),其余試劑為分析純.

1.5桂花果皮醇提物的抑菌活性

1.5.1濾紙片擴(kuò)散法 參照文獻(xiàn)[16]方法，根據(jù)有無(wú)抑菌圈、抑菌圈直徑判定提取物的抑菌活性.用打孔器制備5 mm濾紙圓片，滅菌后烘干.分別將10 μL一定質(zhì)量濃度桂花皮醇提取物滴在各濾紙圓片上，以體積分?jǐn)?shù)75%乙醇為陽(yáng)性對(duì)照，以蒸餾水為空白對(duì)照.分別移取0.1 mL菌懸液，用滅菌的涂布棒均勻涂布到牛肉膏蛋白胨瓊脂固體培養(yǎng)基，用無(wú)菌鑷子夾取各處理過(guò)的濾紙片，置于培養(yǎng)基上，每皿貼4張.37 ℃培養(yǎng)24 h，測(cè)定抑菌圈直徑，重復(fù)3次.

1.5.2比濁法 參照文獻(xiàn)[17]方法，測(cè)定醇提物的抑菌活性.以體積分?jǐn)?shù)75%乙醇為陽(yáng)性對(duì)照，以只加0.10 mL菌懸液、4.90 mL培養(yǎng)基為空白對(duì)照.將桂花皮醇提物稀釋成不同的濃度，分別吸取0.10 mL加入裝有4.8 mL無(wú)菌液體培養(yǎng)基的一系列試管，再加入0.10 mL菌懸液，塞上棉塞，震蕩混勻.在37 ℃條件培養(yǎng)24 h.用液體培養(yǎng)基調(diào)零，600 nm處測(cè)定各個(gè)試管的OD值，重復(fù)3次.

1.5.3測(cè)定最小抑菌濃度(MIC) 參照文獻(xiàn)[18]方法，采用試管2倍稀釋法測(cè)定醇提物的最小抑菌質(zhì)量濃度.取2組各9支無(wú)菌試管，每管各加2.00 mL滅菌培養(yǎng)基，先在第1支試管中加桂花皮醇提物2.00 mL，混勻后吸出2.00 mL置于第2支試管，混勻后再吸取2.00 mL至第3支試管，如此連續(xù)稀釋至第7管，混勻后棄去2.00 mL；第8支試管不加提取物，作為空白對(duì)照；第9支試管不加細(xì)菌只加提取物2.00 mL，混勻后棄去2.00 mL，觀察提取物是否有污染.第二組的1～7支試管，分別加入0.1 mL的105CFU/mL大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的菌懸液，混勻，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果.與第8、9支試管比較，第1～7支試管中不發(fā)生混濁變化的最高提取物稀釋倍數(shù)的濃度，即為MIC值，重復(fù)測(cè)定3次.

1.6桂花果皮醇提物的抗氧化活性參照文獻(xiàn)[19-20]方法，分別測(cè)定桂花果皮醇提物清除DPPH·和ABTS·的能力，評(píng)價(jià)其抗氧化活性.

1.6.1清除DPPH·的活性 分別取質(zhì)量濃度25、50、100、125、200、250 mg/mL的醇提取溶液各200 μL置于試管，各加3.8 mL質(zhì)量濃度為80 mg/L的甲醇-DPPH溶液，混勻，避光1 h，515 nm處測(cè)得樣品吸光度值(Ai).以不加樣品，加體積分?jǐn)?shù)70%乙醇的甲醇-DPPH溶液為空白，測(cè)得空白吸光度值(A0)；以無(wú)甲醇-DPPH溶液為對(duì)照，測(cè)得對(duì)照吸光度值(Aj).以3.8 mL甲醇加200 μL的體積分?jǐn)?shù)70%乙醇為調(diào)零溶液，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.按公式計(jì)算清除率：

DPPH·清除率(%)=

[1-(Ai-Aj)/A0]×100%，

Ai為樣品吸光度值；Aj為對(duì)照吸光度值；A0為空白吸光度值.

1.6.2清除ABTS·的活性 先將ABTS溶液與過(guò)硫酸鉀溶液等體積混合，置暗處12 h，再用甲醇稀釋?zhuān)钡皆?34 nm處吸光度值達(dá)到0.688～0.702，即得ABTS·溶液.分別取不同質(zhì)量濃度樣品200 μL，各加入3.8 mL的ABTS·溶液，靜置1 min，在734 nm處測(cè)得樣品吸光度值(Ai)；再取3.8 mL 的ABTS·溶液與適量體積的體積分?jǐn)?shù)70%乙醇，混合后測(cè)得空白吸光度值(A0).200 μL的體積分?jǐn)?shù)70%乙醇和3.8 mL蒸餾水混合，作為調(diào)零空白液.實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，按公式計(jì)算清除率：

ABTS·清除率(%)=(1-Ai/A0)×100%,

其中,Ai為樣品吸光度值，A0為空白吸光度值.

1.7統(tǒng)計(jì)與分析用SPSS 17.0軟件進(jìn)行方差分析，多重比較用LSD法[21]，結(jié)果以means±std表示.

2 結(jié)果與分析

2.1濾紙片擴(kuò)散法測(cè)定的抑菌活性采用濾紙片擴(kuò)散法，在牛肉膏固體培養(yǎng)基，分別測(cè)定桂花果皮醇提物對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌活性，結(jié)果見(jiàn)表1.

從表1可知，與無(wú)菌水空白比較，桂花果皮醇提物對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌都有一定的抑制作用，差異極顯著(P<0.01)，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈(8.98±0.413) mm，抑菌效果為低敏，而對(duì)大腸桿菌的抑菌圈(10.09±0.605) mm，抑菌效果為中敏.而與體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇比較，桂花果皮醇提物對(duì)這兩種菌的抑菌效果均有顯著或極顯著的差異.桂花果皮醇提物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈(8.98±0.413) mm較體積分?jǐn)?shù)75%乙醇的抑菌圈(6.37±0.187) mm大，而對(duì)大腸桿菌的抑菌圈為(10.09±0.605) mm也較體積分?jǐn)?shù)75%乙醇的抑菌圈(6.67±0.255) mm更大.

表1 桂花果皮醇提物對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌活性(n=3)

注：“-”抑菌圈直徑小于6 mm，判定無(wú)抑菌效果；“+”抑菌圈直徑6～10 mm，為低敏；“++”抑制圈直徑，為中敏.與無(wú)菌水比較，**P<0.01，差異極顯著；與體積分?jǐn)?shù)75%乙醇比較，#P≤0.05，差異顯著；##P<0.01，差異極顯著.

無(wú)菌水空白對(duì)照的抑菌圈為0.00 mm，表明無(wú)外來(lái)污染的影響，無(wú)菌操作可控，實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確可信.設(shè)體積分?jǐn)?shù)75%乙醇的對(duì)照，其對(duì)大腸桿菌的抑菌圈為(6.67±0.255) mm，而對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈(6.37±0.187) mm，說(shuō)明體積分?jǐn)?shù)75%乙醇對(duì)兩類(lèi)供試細(xì)菌均具有一定的抑菌效果.試驗(yàn)結(jié)果表明：與體積分?jǐn)?shù)75%乙醇比較，桂花果皮醇提物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈較大(8.98±0.413) mm，差異性達(dá)到顯著(P≤0.05)，而對(duì)大腸桿菌的抑菌圈更大(10.09±0.605) mm，差異極顯著(P<0.01).對(duì)G+和G-菌的抑制作用，桂花果皮醇提物的效果明顯高于體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇.

2.2比濁法測(cè)定的抑菌活性采用比濁法，測(cè)定桂花果皮醇提物對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌作用，結(jié)果見(jiàn)表2.

從表2可知，桂花果皮醇提物對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌效果均極顯著(P<0.01)，且隨桂花果皮醇提物質(zhì)量濃度的增加，抑菌效果增強(qiáng).與體積分?jǐn)?shù)75%乙醇比較，桂花果皮醇提物有極顯著的差異性(P<0.01)，體積分?jǐn)?shù)75%乙醇對(duì)大腸桿菌的抑菌率為2.55%，最低質(zhì)量濃度125 mg/mL的桂花果皮醇提物的抑菌率達(dá)20.94%；而對(duì)金黃色葡萄球菌，體積分?jǐn)?shù)75%乙醇的抑菌率為2.23%，最低質(zhì)量濃度125 mg/mL桂花果皮醇提物的抑菌率達(dá)19.14%.因此，最低質(zhì)量濃度125 mg/mL的桂花果皮醇提物對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑制率，明顯高于體積分?jǐn)?shù)75%乙醇.桂花果皮醇提物質(zhì)量濃度500 mg/mL時(shí)對(duì)大腸桿菌的抑菌率達(dá)到91.66%，而對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌率91.39%，桂花果皮醇提物對(duì)兩類(lèi)細(xì)菌的抑制率均大于90%.

表2 桂花果皮醇提物對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑制率(n=3)

注：與空白對(duì)照比較，**P<0.01，差異極顯著；與乙醇比較##P<0.01，差異極顯著.

2.3桂花果皮醇提物的最低抑菌質(zhì)量濃度(MIC) 采用試管二倍稀釋法，測(cè)定桂花果皮醇提物的MIC值，結(jié)果見(jiàn)表3.

表3 桂花果皮醇提物對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度(MIC)(n=3)

注：“-”表示溶液清澈，無(wú)菌生長(zhǎng)；“+”表示有少量細(xì)菌生長(zhǎng);“++”表示有較多細(xì)菌生長(zhǎng)；“+++”表示溶液混濁，細(xì)菌正常生長(zhǎng)，無(wú)抑菌效果.

結(jié)果表明：桂花果皮醇提物對(duì)金黃色葡萄球菌的最低抑菌質(zhì)量濃度為62.5 mg/mL，對(duì)大腸桿菌的最低抑菌質(zhì)量濃度為125 mg/mL.結(jié)果提示，桂花果皮醇提物對(duì)G+菌的MIC值比對(duì)G-的MIC值小，可能對(duì)兩類(lèi)細(xì)菌的抑制作用機(jī)理有差異.

2.4桂花果皮醇提物對(duì)DPPH·的清除活性用DPPH法測(cè)定桂花果皮醇提物清除自由基的能力，評(píng)價(jià)其抗氧化活性，結(jié)果見(jiàn)圖1.

桂花果皮醇提物質(zhì)量濃度(以生藥計(jì))(mg/mL)

從圖1中，桂花果皮醇提物對(duì)DPPH·有明顯的清除能力，隨其質(zhì)量濃度的增加，清除DPPH·的活性增強(qiáng)，表現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系.桂花果皮醇提物質(zhì)量濃度大于100 mg/mL，其清除DPPH·的活性達(dá)90%以上，趨于平緩.

在測(cè)定條件下，桂花果皮醇提物質(zhì)量濃度與自由基清除率的擬合曲線方程為

y=27.215ln(x)-31.151，R2=0.938 2，

桂花果皮醇提物對(duì)DPPH·的IC50值為19.145 mg/mL.

2.5桂花果皮醇提物對(duì)ABTS·的清除活性用ABTS法測(cè)定桂花果皮醇提物清除自由基的能力，從而評(píng)價(jià)其抗氧化活性，結(jié)果見(jiàn)圖2.

桂花果皮醇提物質(zhì)量濃度(以生藥計(jì))/(mg/mL)

從圖2可以看出：桂花果皮醇提物對(duì)ABTS·的清除能力顯著，隨其質(zhì)量濃度的增加，對(duì)ABTS·的清除率明顯增強(qiáng)，表現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系.當(dāng)醇提物質(zhì)量濃度達(dá)到50 mg/mL時(shí)，清除率高達(dá)95%，隨后質(zhì)量濃度再增加，對(duì)ABTS·的清除率趨于平緩.

在測(cè)定條件下，桂花果皮醇提物質(zhì)量濃度與其ABTS·清除率的擬合曲線方程為

y=7.727 5ln(x)-62.87，R2=0.955 3，桂花果皮醇提物對(duì)ABTS·的IC50值為4.624 mg/mL.

從桂花果皮醇提物清除DPPH·和ABTS·的清除率、IC50值來(lái)看，抗氧化活性都很高，而且都表現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系.

3 結(jié)論

桂花果皮用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇作為溶劑，制備得到醇提物，測(cè)定該醇提物的抑菌活性、抗氧化活性，為進(jìn)一步研究桂花果皮的抑菌成分、抑菌機(jī)理等研究奠定了一定的基礎(chǔ).

革蘭氏陰性的大腸桿菌、革蘭氏陽(yáng)性的金黃色葡萄球菌是常見(jiàn)的食源性條件致病菌[22]，以抑菌圈、MIC為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用濾紙片擴(kuò)散法、比濁法和試管二倍稀釋法，測(cè)定桂花果皮醇提物對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑制效果.濾紙片擴(kuò)散法的結(jié)果表明，桂花果皮醇提物對(duì)G+和G-兩類(lèi)細(xì)菌的抑菌效果，均達(dá)到顯著或極顯著；比濁法的結(jié)果表明，質(zhì)量濃度500 mg/mL的桂花果皮醇提物，對(duì)G+和G-兩類(lèi)細(xì)菌的抑制率都達(dá)到90%以上.桂花果皮醇提物對(duì)大腸桿菌的MIC值為125 mg/mL，對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC值為62.5 mg/mL.因此，桂花果皮醇提物具有顯著的抑菌活性.桂花果皮醇提物清除DPPH·的IC50值為 19.145 mg/mL，而清除ABTS·的IC50值為4.624 mg/mL，且都表現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系，此結(jié)果表明，桂花果皮醇提物有明顯的抗氧化活性.

綜上所述，桂花果皮的醇提物具有一定的抑菌和抗氧化活性，作為未利用的植物副產(chǎn)物，桂花果皮有望開(kāi)發(fā)成防腐劑或抗氧化劑，以期為桂花資源的高效利用提供理論參考.

致謝四川師范大學(xué)大精設(shè)備項(xiàng)目(DJ2016-08)、食品與藥品制造檢驗(yàn)綜合應(yīng)用的實(shí)踐、生物技術(shù)應(yīng)用型人才培養(yǎng)綜合改革研究與實(shí)踐、四川師范大學(xué)創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201610636120)對(duì)本文給予了資助，謹(jǐn)致謝意.