宋賢沖，唐健

(廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院，廣西 南寧 530002；廣西優(yōu)良用材林資源培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530002；國(guó)家林業(yè)局中南速生材繁育實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530002)

金輝，吳雪

(廣西壯族自治區(qū)產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院, 廣西 南寧 530007)

鄧小軍,覃其云,石媛媛

(廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院，廣西 南寧 530002；廣西優(yōu)良用材林資源培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530002；國(guó)家林業(yè)局中南速生材繁育實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530002)

磷是林木生長(zhǎng)必不可少的大量元素之一，然而在我國(guó)南方尤其是廣西，由于土壤中的固定作用強(qiáng)烈，導(dǎo)致土壤中有效磷缺乏[1]。為了提高林木的生產(chǎn)力，林木施肥日益受到林業(yè)生產(chǎn)者的重視，但大量投入的磷肥僅有一小部分被林木吸收利用，絕大多數(shù)磷迅速轉(zhuǎn)化成難溶性的磷存在于土壤中，或是被雨水沖刷進(jìn)入水體中[2]。因此，研發(fā)土壤磷素利用效率的高效微生物磷肥十分迫切。

馬尾松(PinusmassonianaLamb.)是廣西主要的用材林樹(shù)種之一，同時(shí)也是我國(guó)主要的松脂生產(chǎn)樹(shù)種[3]。研究表明，不同種源和家系的馬尾松吸收和利用土壤磷素能力存在顯著差異，磷素缺乏對(duì)馬尾松根系構(gòu)型和生長(zhǎng)有顯著的影響[4，5]，磷素是影響馬尾松生長(zhǎng)的主要因子[6]。根際是植物與土壤進(jìn)行物質(zhì)交換最活躍的界面，有研究表明根際土壤解磷微生物數(shù)量比非根際高1～2個(gè)數(shù)量級(jí)[7]。因此，本研究對(duì)廣西馬尾松根際土壤溶磷菌進(jìn)行了分離篩選，以期篩選出高效的溶磷菌株，為進(jìn)一步研制微生物磷肥提供基礎(chǔ)資料和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

馬尾松根際土壤樣品采集自廣西主要馬尾松種植區(qū)，包括寧明廣西國(guó)有派陽(yáng)山林場(chǎng)、梧州和田林等地。在樹(shù)木周?chē)帱c(diǎn)挖取0～20cm土層內(nèi)的根系，先將大塊不含根系的土壤抖落，然后取近根系表面的細(xì)粒土壤，裝入無(wú)菌自封袋內(nèi)混勻，作為根際土壤。所有試劑均為分析純或化學(xué)純。

溶磷菌篩選培養(yǎng)基采用NBRIP培養(yǎng)基，制作方法參考文獻(xiàn)[8]。細(xì)菌分離、純化和培養(yǎng)采用營(yíng)養(yǎng)瓊脂和LB培養(yǎng)基，分別購(gòu)買(mǎi)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司和北京索萊寶科技有限公司。溶磷效果測(cè)定采用PVK(Pikovskaya)液體培養(yǎng)基，制作方法參考文獻(xiàn)[9]。

1.2 方法

1.2.1 溶磷菌的篩選與分離

稱(chēng)取10g土樣溶于90mL無(wú)菌水中，用10倍稀釋法分別配制10-3、10-4g/mL的土壤懸液，分別涂布到分離培養(yǎng)基上，35℃倒置培養(yǎng)3d，觀察出現(xiàn)溶磷圈的菌落，測(cè)定溶磷圈直徑(D)、菌落直徑(d)，根據(jù)能否產(chǎn)生溶磷圈與D/d值大小來(lái)初步確定菌株的溶磷能力。挑選D/d值≥1.5的菌株，利用平板劃線純化的方法，將菌株進(jìn)行分離純化。4℃下保存于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面，-20℃下保存菌種于甘油管中。

1.2.2 溶磷菌溶磷效果的測(cè)定

將分離純化獲得的細(xì)菌挑取一環(huán)，接種到LB培養(yǎng)基中，取生長(zhǎng)在對(duì)數(shù)期的菌液，以1%(v/v)的接種量接入到PVK培養(yǎng)基中，35℃、180r/min恒溫?fù)u床震蕩培養(yǎng)3d。取發(fā)酵液5mL 4000r/min離心3min，取上清液測(cè)定有效磷含量和pH。設(shè)不接菌為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次。

用pHS-3C型酸度計(jì)測(cè)定發(fā)酵液的pH；取發(fā)酵上清液稀釋適當(dāng)倍數(shù)，利用731型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在700nm波長(zhǎng)處通過(guò)鉬銻抗比色法[10]測(cè)定光密度值并計(jì)算有效磷含量，溶磷量為接種菌液扣除對(duì)照的有效磷含量；數(shù)據(jù)采用Excel預(yù)處理后，用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.3 溶磷菌的分子生物學(xué)鑒定

細(xì)菌總DNA提取采用天根生化科技(北京)有限公司的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，具體操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

以提取的細(xì)菌DNA為模板，采用通用引物27F和1492R進(jìn)行16S rDNA的PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)在Biometra EasyCycler Gradient PCR儀上進(jìn)行。PCR反應(yīng)體系50μL，其體系為2×Es Taq MasterMix 25μL，27F(10μmol/L)1μL，1492R(10μmol/L)1μL，DNA模板1μL，雙蒸水22μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性2min；94℃變性0.5min，56℃退火0.5min，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸2min。

用1%的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，產(chǎn)物和Marker上樣量均為3μL，電泳結(jié)果于上海天能5200Multi全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光/熒光圖像分析系統(tǒng)成像。PCR產(chǎn)物經(jīng)試劑盒純化后送至南寧國(guó)拓生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行Blast比對(duì)，并通過(guò)軟件Clustal X 1.83和MEGA 4.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離結(jié)果

從馬尾松根際分離獲得1株溶磷菌株，標(biāo)記為DP07。

2.2 溶磷菌的溶磷效果

表1 液體搖瓶培養(yǎng)條件下的溶解效果

將分離到的菌株，接種到PVK液體培養(yǎng)基中進(jìn)行液體發(fā)酵試驗(yàn)，搖瓶培養(yǎng)3d后測(cè)得發(fā)酵液中的有效磷含量和pH變化(表1)。

由表1可知，菌株DP07在培養(yǎng)3d后，對(duì)5.0g/L的磷酸三鈣溶液的溶磷量達(dá)到(3.599±0.24)mg/L，是對(duì)照(CK)的3倍。搖瓶培養(yǎng)3d后，對(duì)照處理和接種菌株處理培養(yǎng)液的pH均有一定程度的下降，接種菌株處理比對(duì)照(CK)的pH低近1個(gè)單位。

圖1 DP07在NBRIP培養(yǎng)基上的菌落和菌體(1000×)

2.3 菌體形態(tài)

分離到的菌株DP07在NBRIP培養(yǎng)基上培養(yǎng)3d后的形態(tài)、透明圈和革蘭氏染色結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，菌株DP07為短桿狀，革蘭氏染色陰性，具運(yùn)動(dòng)性。

2.4 分子生物學(xué)鑒定

利用通用引物，對(duì)溶磷菌株DP07的16S rDNA基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到長(zhǎng)度約為1500bp的擴(kuò)增產(chǎn)物。將其在NCBI網(wǎng)站的blatn數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行在線blast比對(duì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株DP07與Burkholderiaphenaziniumstrain A1(Genbank登錄號(hào)：NR_029212.1)的序列相似度達(dá)到99%。根據(jù)比對(duì)結(jié)果進(jìn)行菌株DP07的系統(tǒng)發(fā)育分析如圖2所示。

圖2 菌株DP07系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3 結(jié)論

從廣西馬尾松根際篩選獲得溶磷菌株1株，經(jīng)菌落觀察及分子生物學(xué)初步鑒定，確定菌株DP07為Burkholderiaphenazinium。

通過(guò)液體發(fā)酵試驗(yàn)，測(cè)定其對(duì)難溶性磷酸三鈣的溶解效果。結(jié)果表明，搖瓶培養(yǎng)3d后，溶磷量達(dá)到(3.599±0.24)mg/L，pH也有明顯下降。