龔 麗，胡恒康， 胡淵淵， 喻衛(wèi)武，吳家勝，黃堅欽， 張啟香

（1.浙江農(nóng)林大學(xué) 林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 杭州311300；2.浙江農(nóng)林大學(xué) 省部共建亞熱帶森林培育國家重點實驗室 浙江 杭州311300）

植物胚性感受態(tài)為植物細胞或組織脫分化能力或潛力，胚性感受態(tài)的高低直接決定了植物體細胞胚誘導(dǎo)的難易程度［1］。研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)植物的組織或細胞維持高水平胚性感受態(tài)的時間極短［2-3］。胚性感受態(tài)水平的高低與基因型、外植體的取材部位、生理學(xué)年齡等密切相關(guān)［4］。在黑核桃Juglans nigra中，授粉后3～4周的幼胚開始具有體胚發(fā)生能力，授粉后6～7周時幼胚體胚發(fā)生頻率最高，此后，體胚發(fā)生能力逐漸下降［5］。在梨Pyrus中，具有胚性感受態(tài)的時間極短，只有當(dāng)梨幼胚發(fā)育期為魚雷胚至子葉胚時，才有少量體胚的誘導(dǎo)與發(fā)生［6］。榧樹Torreya grandis隸屬于裸子植物紅豆杉科Taxaceae榧屬Torreya常綠喬木。香榧Torreya grandis‘Merrillii’是實生榧樹中優(yōu)良變異類型或優(yōu)株經(jīng)人工嫁接繁殖而成的優(yōu)良品種，為中國特有的珍稀干果和木本油料植物，具有重要的經(jīng)濟、社會和生態(tài)價值［7］。由于傳統(tǒng)嫁接繁殖難以滿足目前市場的巨大需求，近年來，研究人員開展了香榧植株體胚發(fā)生及再生體系的建立等研究［8-11］。但由于缺乏對香榧種子內(nèi)幼胚發(fā)育過程及體胚誘導(dǎo)及發(fā)生規(guī)律的深入了解，導(dǎo)致其體胚發(fā)生及再生體系難以穩(wěn)定，有效繁殖系數(shù)低。本研究以不同發(fā)育階段的香榧幼胚為外植體，開展胚性愈傷組織及體細胞胚誘導(dǎo)研究，通過對不同發(fā)育時期來源的幼胚進行誘導(dǎo)率分析，同時輔以幼胚內(nèi)源激素的變化規(guī)律，擬闡明香榧幼胚發(fā)育狀態(tài)與其胚性感受態(tài)之間的相關(guān)性，為建立香榧穩(wěn)定、高效體胚發(fā)生及植株再生體系提供良好的技術(shù)平臺，同時也為后期香榧遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立打下良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

于2014年7月5日至8月23日，選取浙江農(nóng)林大學(xué)試驗基地中良好的香榧植株（圖1A）。香榧種子于5月10日突破種鱗，以此日期為起點計算，即種子突破種鱗后第8周至第15周（以下簡稱第8周至第15周），分8次采集發(fā)育正常、大小適中的種子帶回實驗室待處理。

1.2 實驗方法

將8次采集的香榧種子用解剖刀去除香榧種子的假種皮，放入添加洗滌劑的清水中搓洗數(shù)次并漂洗干凈，在自來水流水下沖洗1～2 h后用吸水紙將種子表面水分吸干。在超凈工作臺上用體積分數(shù)為75%乙醇表面滅菌處理好的香榧種子3 min，無菌水沖洗3～4次，再用稀釋10倍的次氯酸鈉（NaClO）溶液（每50 mL加1滴吐溫）真空抽濾20 min，無菌水沖洗5～6次，無菌吸水紙吸干種子表面水分后等用。用無菌修枝剪從表面滅菌后的種子頂端（俗稱榧眼端）縱向剪開，在體視顯微鏡（Zeiss Stereo Discovery V12）下用解剖針剝?nèi)⊥暾着?，待用?/p>

1.2.1 不同發(fā)育時期幼胚內(nèi)源吲哚乙酸（IAA）及脫落酸（ABA）的質(zhì)量分數(shù)測定 將8個不同發(fā)育時期的香榧幼胚（每次剝?nèi)?.2 g左右），立即用液氮速凍，放入－70℃的低溫冰箱內(nèi)以備內(nèi)源激素質(zhì)量分數(shù)測定。內(nèi)源激素質(zhì)量分數(shù)測定時每0.1 g樣品加入1 mL內(nèi)含1 mmol·L－1二叔丁基對甲苯酚的80%甲醇提取液，弱光下冰浴研磨冰凍鮮樣成勻漿，轉(zhuǎn)入離心管中，再用1 mL提取液分次沖洗研缽，一并轉(zhuǎn)入離心管中。4℃下提取4 h，1 000g離心15 min取上清液，殘渣加入1 mL提取液4℃下提取1 h，合并上清液。上清液過18C固相萃取柱后，用氮氣吹干。過柱后的樣品用pH 7.4的磷酸緩沖液溶解后，將樣品甲脂化，即用氮氣吹干，之后再用甲醇溶解，在冰浴條件下加過量的重氮甲烷反應(yīng)至黃色，10 min后加半滴0.2 mol·L－1乙酸甲醇破壞過量的重氮甲烷（黃色消失），用氮氣吹干，磷酸緩沖液溶解后進行酶聯(lián)吸附法（ELSA）測定ABA和IAA質(zhì)量分數(shù)（分母為幼胚鮮質(zhì)量）。每個處理重復(fù)3次。

圖1 香榧種子及幼胚生物學(xué)特性Figure 1 Characters of seeds and immature embryos of Torreya grandis ‘Merrillii’

1.2.2 香榧胚性愈傷組織及體胚誘導(dǎo) 將8個不同發(fā)育時期的香榧幼胚取出后，接種在胚性愈傷組織及體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基成分如下：①以1/2 SH為基本培養(yǎng)基［12］，附加0.1 mg·L－1萘乙酸（NAA），2 g·L－1活性碳， 30 g·L－1蔗糖； ②1/2 SH 基本培養(yǎng)基， 附加 0.1 mg·L－1NAA， 0.5 g·L－1谷氨酰胺， 2 g·L－1活性碳，30 g·L－1蔗糖；③1/2 SH基本培養(yǎng)基（對照）。培養(yǎng)基附加4 g·L－1瓊脂，pH 5.7，暗培養(yǎng)。每處理接種20個幼胚，重復(fù)3次。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 每天觀察幼胚生長情況，當(dāng)幼胚暗培養(yǎng)4周時，在體視顯微鏡下觀察胚性愈傷組織、體胚誘導(dǎo)以及幼胚萌發(fā)情況，統(tǒng)計各處理下胚性愈傷組織誘導(dǎo)率、體胚發(fā)生率以及幼胚直接萌發(fā)率。實驗數(shù)據(jù)采用SigmaPlot 8.0和SPSS 17.0進行統(tǒng)計分析，Duncan新復(fù)極差檢驗法進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 香榧幼胚發(fā)育的形態(tài)特征觀察

觀察發(fā)現(xiàn)，成熟的香榧種子具假種皮，綠色纖維質(zhì)（圖1A）。剝?nèi)ゼ俜N皮，可見棕褐色外種皮，堅硬木質(zhì)化（圖1B，圖1C箭頭2所示）。內(nèi)種皮暗紅色，褶皺膜質(zhì)，內(nèi)陷成脊?fàn)睿▓D1C，箭頭1所示）。胚乳單倍體，乳白色，為主要可食用部位（圖1C，箭頭3所示）。香榧幼胚位于種子榧眼端雌配子體腔內(nèi)，細小不明顯（圖1C，橢圓所示，圖1D），幼胚胚體和胚柄系統(tǒng)相連，胚柄系統(tǒng)靠近珠孔端，胚頭部遠離珠孔端。香榧胚發(fā)育經(jīng)歷多胚時期、胚胎選擇時期和優(yōu)勢胚完全發(fā)育等3個時期。通過胚胎選擇，多個香榧幼胚最后僅有1個發(fā)育較好，其他幼胚在不同發(fā)育階段終止發(fā)育而萎縮。香榧早期幼胚為棒狀（圖1E,F），隨著幼胚發(fā)育成熟，頭部逐漸膨大，直至子葉展開，胚柄萎縮脫落（圖1G，H）。

2.2 不同胚齡對香榧幼胚內(nèi)源ABA及IAA質(zhì)量分數(shù)的影響

不同發(fā)育時期香榧幼胚的內(nèi)源IAA及ABA質(zhì)量分數(shù)具顯著性差異（P＜0.05）。香榧幼胚內(nèi)源IAA的質(zhì)量分數(shù)在胚珠突破種鱗后第8周處于最大值，達53.90 ng·g－1，第9周稍有下降，但與第8周之間無顯著性差異，之后迅速下降至44.14 ng·g－1。隨著胚齡的逐漸增加，內(nèi)源IAA質(zhì)量分數(shù)總體呈小幅波動的下降趨勢，第 15周最低，為 35.60 ng·g－1（圖 2）。

香榧幼胚內(nèi)源ABA質(zhì)量分數(shù)的測定結(jié)果表明：幼胚胚齡對其內(nèi)源ABA的質(zhì)量分數(shù)同樣具有顯著影響（P＜0.05）。在種鱗突破種皮后的第8至第15周內(nèi)，隨著胚齡的增加，內(nèi)源ABA質(zhì)量分數(shù)呈先下降后上升的總趨勢，其中第8周至第10周，內(nèi)源ABA質(zhì)量分數(shù)先下降后上升，但變化幅度比較??；第10周到第12周處于快速上升期，從第10周的89.80 ng·g－1上升到第12周的144.67 ng·g－1；第13至15周內(nèi)源ABA處于變化平緩期，且維持在較高水平，其中第14周和第15周內(nèi)源ABA質(zhì)量分數(shù)無顯著差異，第15周達到最大值，為160.20 ng·g－1（圖2）。

2.3 不同胚齡對香榧幼胚胚性感受態(tài)的影響

不同發(fā)育階段香榧幼胚的胚性感受態(tài)具顯著差異；同時，不同離體培養(yǎng)條件對香榧幼胚的胚性感受態(tài)激發(fā)也有顯著差異（表1，圖3，圖4）。將香榧幼胚接種于1/2 SH基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當(dāng)幼胚胚齡較小時，可產(chǎn)生極少量胚性愈傷組織，但從第10周開始，胚性愈傷組織誘導(dǎo)率均為0，但各胚齡幼胚均未誘導(dǎo)直接產(chǎn)生體胚。將幼胚接種于附加0.1 mg·L－1NAA的1/2 SH基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)，隨著幼胚胚齡的增加，胚性愈傷組織誘導(dǎo)率先上升后下降，其中第8周幼胚的胚性愈傷組織誘導(dǎo)率為48.1%，第9周時略有升高，達到最高值，為48.3%，隨后逐漸下降，第14至第15周胚性愈傷組織誘導(dǎo)率為0；將香榧幼胚置于1/2 SH基本培養(yǎng)基附加0.1 mg·L－1NAA的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，隨著胚齡的增加，誘導(dǎo)率也呈先上升后下降的趨勢，第8周體胚誘導(dǎo)率為0，第9周體胚誘導(dǎo)率上升為5.8%，至第10周體胚誘導(dǎo)率達到最高，為42.7%，后隨著胚齡的增加，體胚誘導(dǎo)率逐漸下降，第14周至第15周體胚誘導(dǎo)率為0（圖3）。

圖2 香榧幼胚胚齡對其內(nèi)源IAA及ABA質(zhì)量分數(shù)的影響Figure 2 Effectofdevelopmentalstageson endogenous IAA and ABA content of immature embryo in Torreya grandis‘Merrillii’

表1 胚齡及萘乙酸對香榧幼胚胚性感受態(tài)的影響Table 1 Effect of developmental stages and NAA on embryo genic frequency of Torreya grandis ‘Merrillii’ immature embryos

第8周至第15周的幼胚進行離體萌發(fā)試驗發(fā)現(xiàn)，不同外植體發(fā)育階段及培養(yǎng)條件對萌發(fā)率具有顯著影響（圖4）。將幼胚培養(yǎng)于1/2 SH基本培養(yǎng)基中，萌發(fā)率隨著胚齡的增加而升高，第8周至第9周幼胚萌發(fā)率為0，從第10周開始，萌發(fā)率逐漸上升，第14周時達最高值，為65.1%，之后略有下降。而當(dāng)幼胚培養(yǎng)于附加0.1 mg·L－11/2 SH培養(yǎng)基NAA中進行萌發(fā)培養(yǎng)時，香榧幼胚極易產(chǎn)生愈傷組織而不能正常萌發(fā)形成有效苗（圖5）。

3 結(jié)論與討論

圖3 胚齡對胚性愈傷組織及體胚直接發(fā)生的影響Figure 3 Effect of immature embryo developmental stages on embryogenic callus induction and direct somatic embryogenesis （SH+0.1 mg·L-1NAA）

圖4 胚齡及培養(yǎng)條件對香榧幼胚萌發(fā)的影響Figure 4 Effect of immature embryo developmental stages and media on in vitro germination

圖5 不同胚齡對香榧幼胚胚性感受態(tài)的影響Figure 5 Embryogenic frequency of immature embryos under different developmental stages

體細胞胚胎發(fā)生在植物組織培養(yǎng)過程中，外植體材料的基因型、發(fā)育階段以及生理狀態(tài)等決定了其胚性感受態(tài)的強弱。對于多數(shù)植物來說，特定階段幼胚的胚性感受態(tài)明顯強于其他階段［13］。目前，已有多種裸子植物經(jīng)誘導(dǎo)成功獲得了體細胞胚［14］。與被子植物不同，裸子植物體細胞胚誘導(dǎo)對外植體的要求更加嚴格，一般情況下，以胚性感受態(tài)較高的幼胚為外植體進行體胚誘導(dǎo)。如，在火炬松Pinus taeda，華北落葉松Larix principis-rupprechtii等針葉樹，需采用各發(fā)育階段的幼胚為外植體進行體胚誘導(dǎo)［15-19］。除此以外，部分研究還采用了未成熟的雌配子體為外植體成功獲得了體細胞胚［20-22］。本研究采用香榧胚珠突破種鱗后第8～15周的幼胚為外植體，第9周幼胚胚性愈傷組織誘導(dǎo)率最高，達54.3%，第11周幼胚的體胚直接發(fā)生率最高，達48.4%，表明不同發(fā)育時期對香榧幼胚胚性感受態(tài)具顯著影響。然而，盡管幼胚在某些階段（如子葉胚早期、子葉胚晚期等）具有良好的胚性感受態(tài)，但對于絕大多數(shù)植物來說，植物組織由于幼胚胚性感受態(tài)表現(xiàn)出的細胞全能性仍需要合適的條件下才能受到激發(fā)。本研究中將香榧幼胚培養(yǎng)于附加0.1 mg·L－1NAA的SH基本培養(yǎng)基時，無論是胚性愈傷組織誘導(dǎo)率還是體細胞胚直接發(fā)生率，都顯著高于在SH基本培養(yǎng)基中的誘導(dǎo)結(jié)果，說明香榧幼胚胚性感受態(tài)也需要特定條件（外源NAA）激發(fā)。

幼胚胚性感受態(tài)需在特定條件下才能被激活的現(xiàn)象與植物幼胚體的生理狀態(tài)密切相關(guān)［18,23］。植物的內(nèi)源激素是影響組織胚性感受態(tài)的最重要因素之一。以香雪蘭Freesia refracta花序為外植體進行體細胞胚誘導(dǎo)，花序的形態(tài)學(xué)上端無體細胞形成，而下端可分化出體細胞胚。檢測結(jié)果表明，體細胞胚誘導(dǎo)前的花序形態(tài)學(xué)上下兩端內(nèi)源IAA質(zhì)量分數(shù)無明顯差別，但培養(yǎng)后形態(tài)學(xué)下端（體細胞胚發(fā)生端）IAA質(zhì)量分數(shù)明顯高于上端，表明內(nèi)源IAA質(zhì)量分數(shù)是香雪蘭花序誘導(dǎo)產(chǎn)生體細胞胚的主導(dǎo)因子之一［24］。本研究第8周至第11周幼胚的內(nèi)源IAA質(zhì)量分數(shù)較高，此時極易誘導(dǎo)胚性愈傷組織或體細胞胚，說明高質(zhì)量分數(shù)內(nèi)源IAA可能提高幼胚的胚性感受態(tài)，使幼胚易于受外源激素誘導(dǎo)并脫分化。現(xiàn)有研究表明，ABA對于植物胚的正常發(fā)育和防止早萌具有重要作用［25］。不僅如此，ABA對胚發(fā)育調(diào)節(jié)作用與胚的發(fā)育程度有關(guān)，果針入土后10 d的花生幼胚，在無外源植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的培養(yǎng)基中能夠正常發(fā)育，而果針入土后20 d的花生幼胚需要越來越高的外源ABA維持才能正常發(fā)育［26］。本研究中香榧幼胚第8～11周幼胚內(nèi)源ABA質(zhì)量分數(shù)較低，此時幼胚的胚性感受態(tài)較高，隨著胚齡增加，ABA質(zhì)量分數(shù)快速上升并維持在較高水平，但幼胚胚性感受態(tài)逐漸降低，可能與ABA可以促進香榧胚胎發(fā)育成熟有關(guān)，此現(xiàn)象與一定質(zhì)量分數(shù)ABA促進華北落葉松、云杉Picea等裸子植物體胚成熟相似［19,27］。

綜上所述，香榧第8～12周幼胚具有較高的胚性感受態(tài)，同時，通過對幼胚內(nèi)源激素的測定，對維持外植體高胚性感受態(tài)，開展香榧胚性愈傷組織及體胚發(fā)生培養(yǎng)條件的篩選提供了技術(shù)指導(dǎo)。香榧幼胚發(fā)育狀態(tài)與胚性感受態(tài)之間的相關(guān)性是以幼胚為外植體進行胚性愈傷組織及體細胞胚的重要環(huán)節(jié)。由此掌握精確幼胚取樣時間，準確采樣，極大縮短體細胞胚誘導(dǎo)及培養(yǎng)的周期，大大降低培養(yǎng)成本，可為香榧遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立提供良好的技術(shù)平臺。

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