(青島大學(xué)，山東 青島 266003 1 附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科； 2 醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室)

EB病毒(EBV)是重要的DNA腫瘤病毒，與鼻咽癌、胃癌、淋巴瘤等多種腫瘤的發(fā)生相關(guān)[1-6]。其中90%以上的低分化鼻咽癌(NPC)組織中可檢測(cè)到EBV的存在，NPC發(fā)病存在家族聚集性、種族易感性及地域集中性。近年來(lái)，易感基因及病毒感染已逐步成為NPC發(fā)病的重要因素[7]，包括EBV基因在內(nèi)的許多基因已被證實(shí)為NPC的易感基因，其多態(tài)性直接影響NPC的發(fā)病機(jī)制及病理類(lèi)型[8-10]。Vps28是內(nèi)吞體分選轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體(ESCRT)的組成結(jié)構(gòu)之一[11]，ESCRT在細(xì)胞分選及降解泛素化膜蛋白這一過(guò)程中發(fā)揮重要作用，使一些激素、生長(zhǎng)因子及細(xì)胞因子受體在與配體結(jié)合后內(nèi)化并被溶酶體降解，導(dǎo)致受體表達(dá)下調(diào)，從而在信號(hào)衰減中起著重要作用[12-13]。表皮生長(zhǎng)因子與受體結(jié)合導(dǎo)致受體活化，誘發(fā)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，控制細(xì)胞的一系列功能，ESCRT在此過(guò)程中起到負(fù)向調(diào)節(jié)功能，其結(jié)構(gòu)的變異可引起調(diào)節(jié)異常，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[14-16]。因此，探討Vps28在EBV相關(guān)腫瘤發(fā)生機(jī)制中的作用具有實(shí)踐指導(dǎo)意義。本文研究首次對(duì)EBV相關(guān)NPC(EBVaNPC)組織及EBV相關(guān)淋巴瘤(EBVaL)組織中Vps28基因rs2272658位點(diǎn)多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)，以期明確其多態(tài)性與EBV相關(guān)腫瘤的發(fā)生是否存在相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

采用原位雜交技術(shù)檢測(cè)105例NPC及136例淋巴瘤石蠟包埋組織切片中EBV編碼的小分子非多聚腺苷酸EBER1的轉(zhuǎn)錄表達(dá)[17]，篩選出93例EBVaNPC組織，12例EBV陰性NPC(EBV-negative nasopharyngeal carcinoma，EBVnNPC)組織，87例EBVaL組織，49例EBV陰性淋巴瘤(EBV-negative lymphoma，EBVnL)組織。同時(shí)選取我院健康體檢者100例作為正常對(duì)照組(NC組)。NC組均已排除各種感染、腫瘤及自身免疫??；各組間種族構(gòu)成、年齡分布和性別構(gòu)成在各病例組(包括鼻咽癌組及淋巴瘤組)與NC組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 細(xì)胞DNA提取

NC組采集空腹靜脈血5 mL，EDTA抗凝，分離外周血單個(gè)核細(xì)胞。采用QIAamp DNA FFPE試劑盒(Qiagen，德國(guó))并按說(shuō)明書(shū)提取石蠟包埋腫瘤組織DNA。外周血單個(gè)核細(xì)胞DNA提取采用酚-氯仿-異戊醇法，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 Vps28基因rs2272658位點(diǎn)多態(tài)性的檢測(cè)

利用AssayDesigner 3.1軟件設(shè)計(jì)Vps28基因rs2272658位點(diǎn)的反應(yīng)引物，引物序列如下：上游引物：5′-ACGTTGGATGAACTGTTCCTGAGGCAC-TCC-3′；下游引物：5′-ACGTTGGATGTAGAGCC-CAGAGTGCTACC-3′。根據(jù)實(shí)驗(yàn)體系依次進(jìn)行PCR、SAP純化反應(yīng)及單堿基延伸反應(yīng)，使用Sequenom公司的MassArray系統(tǒng)進(jìn)行飛行質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)，通過(guò)分析軟件MassArrayTyper 4.0進(jìn)行處理，從而得到Vps28基因rs2272658位點(diǎn)在所有標(biāo)本中的SNP分型。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。采用χ2檢驗(yàn)分析比較基因型和等位基因頻率的分布差異。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組織中Vps28基因rs2272658位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果

在隱性模型當(dāng)中，EBVaNPC組的TT基因型頻率高于NC組(OR=2.07，95%CI=1.16～3.68，χ2=6.21，P<0.05)。EBVaNPC組的T等位基因頻率明顯高于NC組(OR=1.75，95%CI=1.13～2.72，χ2=6.26，P<0.05)。表明TT基因型為EBVaNPC的致病基因型，而T等位基因?yàn)镋BVaNPC的危險(xiǎn)因子。

EBVaNPC組中T等位基因及TT基因型頻率均高于EBVnNPC組(OR=5.07，95%CI=2.08～12.36，χ2=14.71，P<0.01；OR=41.60，95%CI=3.88～447.56，χ2=18.79，P<0.01)。在隱性的模型中，EBVaNPC組中TT基因型的頻率明顯高于EBVnNPC組(OR=13.95，95%CI=1.37～112.53，χ2=9.63，P<0.01)。在顯性模型中，EBVaNPC組CC基因型頻率明顯低于EBVnNPC組(OR=8.80，95%CI=1.962～39.47,χ2=10.60，P<0.01)。表明相對(duì)于EBVnNPC組，TT基因型以及T等位基因?yàn)镋BVaNPC的危險(xiǎn)因子。見(jiàn)表1。

2.2 淋巴瘤組織中Vps28基因rs2272658位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果

EBVaL與EBVnL以及NC組間Vps28基因rs2272658位點(diǎn)的基因型分布無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；EBVaL與EBVnL組及EBVaL與NC組間T等位基因分布均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05)。結(jié)果見(jiàn)表2。

3 討 論

ESCRT是一類(lèi)與腫瘤、神經(jīng)病變性及感染性疾病關(guān)系密切的保守蛋白質(zhì)，參與細(xì)胞增殖、分化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種生命活動(dòng)的調(diào)控，與多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)[18-19]，因此ESCRT的組件受損會(huì)引起一系列的疾病。4種蛋白Vps23、Vps28、Vps37、Mvb12構(gòu)成了復(fù)合體ESCRT-Ⅰ，ESCRT-0、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ以及Vps4 5個(gè)復(fù)合體進(jìn)一步組成了完整的ESCRT。

表1 EBVaNPC組、EBVnNPC組及NC組的Vps28基因rs2272658位點(diǎn)多態(tài)性的分布(例(χ/%))

表2EBVaL組、EBVnL組及NC組的Vps28基因rs2272658位點(diǎn)多態(tài)性的分布(例(χ/%))

組別基因型頻率CCCTTT等位基因頻率CTNC組11(11.00)51(51.00)38(38.00)73(36.50)127(63.50)EBVaL組10(11.49)43(49.43)34(39.08)63(36.21)111(63.79)EBVnL組8(16.32)19(38.78)22(44.90)35(35.71)63(64.29)

研究證明，ESCRT能夠參與病毒的出芽過(guò)程，調(diào)控細(xì)胞自噬。BLECK等[20]研究證實(shí)，ESCRT通路能夠在HIV-I病毒顆粒組裝時(shí)被聚集，并且參與新生病毒質(zhì)膜分裂的過(guò)程，進(jìn)而參與病毒的復(fù)制。有研究結(jié)果顯示，DNA包膜病毒如皰疹病毒和桿狀病毒等的出芽釋放也依賴(lài)于宿主細(xì)胞的ESCRT系統(tǒng)，ESCRT可以協(xié)助EBV調(diào)整核膜結(jié)構(gòu)，促進(jìn)核酸釋放[21]。

ESCRT-I中的Vps23，又稱(chēng)為T(mén)sg101，是一種腫瘤易感基因，能夠促進(jìn)細(xì)胞分裂和增殖，加快細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)體內(nèi)病毒的運(yùn)輸，在人類(lèi)多種腫瘤中高度表達(dá)，檢測(cè)Tsg101可用于評(píng)估腫瘤惡性程度并為靶向治療提供可能的位點(diǎn)[22]。CHUA等[23]報(bào)道，Tsg101能夠與病毒裂解激活酶Rta反應(yīng)，促進(jìn)EBV的晚期基因激活，完成EBV的生產(chǎn)性裂解循環(huán)，具有Tsg101缺陷的細(xì)胞不能表達(dá)晚期病毒蛋白，導(dǎo)致病毒顆粒的產(chǎn)量降低。STUCHELL等[24]研究發(fā)現(xiàn)，Tsg101蛋白發(fā)生突變之后由于不能夠與Vps28蛋白連接，因而使細(xì)胞具備了抑制HIV出芽的能力。因此可以推斷，Vps28與腫瘤易感基因Tsg101關(guān)系較為密切，是病毒復(fù)制及其信號(hào)通路中不可缺少的一部分。Vps28的基因多態(tài)性亦有可能引起Tsg101功能的改變，進(jìn)而影響病毒相關(guān)腫瘤的易感性。

WAGENAAR等[25]研究表明，在Vps28缺失的條件下，肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549對(duì)miR21抑制劑的攝取作用大大增強(qiáng)，侵襲能力明顯減弱，增殖速度降低。上述研究結(jié)果提示，Vps28與miR21在腫瘤中的作用密切相關(guān)，Vps28的基因多態(tài)性在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到了重要的輔助作用。

本研究首次對(duì)Vps28基因rs2272658位點(diǎn)多態(tài)性與EBV相關(guān)腫瘤的易感性進(jìn)行探討。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，EBVaNPC中TT基因型頻率和T等位基因頻率明顯高于EBVnNPC組及NC組，提示T等位基因可能是EBVaNPC發(fā)病的危險(xiǎn)因子，攜帶T等位基因可能會(huì)增加EBVaNPC的易感性。由此可以推斷Vps28基因rs2272658位點(diǎn)多態(tài)性與EBVaNPC具有相關(guān)性。

本研究結(jié)果顯示，EBVaL、EBVnL及NC組間Vps28基因rs2272658位點(diǎn)多態(tài)性分布無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明該位點(diǎn)的多態(tài)性與此類(lèi)疾病無(wú)明顯相關(guān)性。在EBV的生命周期中，口咽部和唾液腺等的上皮組織通常是病毒復(fù)制的主要部位[26-30]，而淋巴瘤為間葉組織中造血組織腫瘤，鑒于兩者組織來(lái)源不同，EBV感染的潛伏類(lèi)型也不盡相同，因此Vps28基因rs2272658位點(diǎn)多態(tài)性與EBV的相互影響更易于發(fā)生在上皮細(xì)胞的腫瘤中[31-32]。

總之，本研究結(jié)果提示Vps28基因rs2272658位點(diǎn)基因型頻率、等位基因頻率與EBVaNPC易感性有關(guān)，攜帶T等位基因會(huì)增加患EBVaNPC的風(fēng)險(xiǎn)，Vps28基因rs2272658位點(diǎn)多態(tài)性與淋巴瘤組織中EBV感染無(wú)相關(guān)性。Vps28基因rs2272658位點(diǎn)多態(tài)性與EBV感染及有關(guān)信號(hào)通路中的相互關(guān)系還有待更進(jìn)一步的研究。