(青島大學(xué)附屬醫(yī)院病理科，山東 青島 266003)

結(jié)直腸癌是最常見的惡性腫瘤之一，隨著人口老齡化的加劇，其發(fā)病率持續(xù)增加[1-2]。近年來，人們在結(jié)直腸癌的分子診斷和靶向治療方面取得了長足的進(jìn)步，但是對(duì)于其具體的侵襲和轉(zhuǎn)移機(jī)制仍不明確。因此，通過分子生物學(xué)的方法對(duì)結(jié)直腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移機(jī)制進(jìn)行研究，對(duì)于結(jié)直腸癌病人的臨床治療以及預(yù)后判斷具有重要的意義。Suppressor Anaphase-promoting complex domain containing 2(SAPCD2)，又被稱為p42.3或C9orf140，是哺乳動(dòng)物體內(nèi)一種新近發(fā)現(xiàn)的高度保守的基因，其影響細(xì)胞周期并參與染色體的分離[3-4]。相關(guān)的研究表明，SAPCD2基因在胃癌、膠質(zhì)瘤、肝癌等多種腫瘤組織中高表達(dá)，并且與腫瘤惡性程度及細(xì)胞增殖和侵襲性相關(guān)[3,5-9]。最近有研究發(fā)現(xiàn)，SAPCD2在結(jié)直腸癌中的表達(dá)顯著增高[2,10]。然而，其在結(jié)直腸癌中過度表達(dá)的意義、分子機(jī)制及相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路尚未闡明，而且SAPCD2在結(jié)直腸腺瘤中的表達(dá)情況尚未見報(bào)道。本研究擬首先采用免疫組織化學(xué)方法檢測SAPCD2在結(jié)直腸正常黏膜、腺瘤及結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)情況，分析其在三種組織中表達(dá)的差異性及其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系；然后采用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)使SAPCD2在結(jié)腸癌RKO細(xì)胞中表達(dá)沉默，通過細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)研究SAPCD2的相關(guān)生物學(xué)功能，進(jìn)一步探討其對(duì)結(jié)腸癌RKO細(xì)胞增殖能力的影響?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

人結(jié)腸癌RKO細(xì)胞系由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院分子病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。胎牛血清購于美國Ausbian公司，細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑、細(xì)胞培養(yǎng)板以及DMEM培養(yǎng)基購買于美國Corning公司，慢病毒表達(dá)載體由上海吉?jiǎng)P公司構(gòu)建，四甲基偶氮唑鹽(MTT)購于美國Genview公司，DMSO購于上海試一化學(xué)試劑公司，SAPCD2兔多克隆抗體(ab126342)購買自美國Abcam公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1組織芯片和免疫組織化學(xué)染色 收集我院病理科2014—2016年接受手術(shù)治療石蠟包埋的結(jié)直腸癌組織及匹配的正常黏膜組織標(biāo)本108例，活檢結(jié)直腸腺瘤標(biāo)本50例(其中13例為108例結(jié)直腸癌中的腺瘤標(biāo)本)，標(biāo)本均經(jīng)常規(guī)病理診斷確診。

使用Pathology Devices TMAjrTM 制作孔徑為 2.0 mm的組織芯片，3 μm厚切片，置于pH 6.0的枸櫞酸中進(jìn)行恒溫水浴抗原修復(fù)35 min，用含體積分?jǐn)?shù)為0.03的H2O2去離子水抑制內(nèi)源性過氧化物酶10 min，滴加濃度為1∶1 500 的SAPCD2兔多克隆抗體4 ℃孵育過夜；滴加二抗酶復(fù)合物HRP試劑于室溫下反應(yīng) 20 min；通過DAB試劑對(duì)組織芯片顯色，蘇木素染色1 min，藍(lán)化，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，封片。組織芯片SAPCD2的表達(dá)情況采用半定量評(píng)估的方法[10]，免疫組織化學(xué)染色的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：①按照染色強(qiáng)度計(jì)分：陰性為0分，弱陽性為1分，中等陽性為2分，強(qiáng)陽性為3分；②按陽性細(xì)胞的百分比計(jì)分：陽性細(xì)胞百分比0為0分，1%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，大于75%為4分。將兩項(xiàng)得分結(jié)果相加：0～3分為低表達(dá)，4～12分為高表達(dá)。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染以及穩(wěn)定細(xì)胞株的構(gòu)建 轉(zhuǎn)染前1 d將處于對(duì)數(shù)生長期的RKO細(xì)胞接種到6孔板上，5×104個(gè)細(xì)胞/孔，待細(xì)胞匯合達(dá)到20%時(shí)；吸除培養(yǎng)液，加入含病毒的培養(yǎng)液；12 h后更換為常規(guī)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；以pLV-shRNA SAPCD2為陽性對(duì)照，pLV-shControl為陰性對(duì)照，72 h后通過熒光顯微鏡觀察，熒光率達(dá)到80%時(shí)，細(xì)胞狀態(tài)正常，收集兩組RKO細(xì)胞，通過RT-PCR檢測兩組細(xì)胞中SAPCD2敲減的效果。

1.2.3MTT實(shí)驗(yàn) 將處于對(duì)數(shù)生長期的兩組細(xì)胞以2.5 g/L胰酶消化，完全培養(yǎng)基重懸成細(xì)胞懸液，并以1 000個(gè)細(xì)胞/孔接種到96孔培養(yǎng)板上；待細(xì)胞完全沉淀以后，以2 h間隔在顯微鏡下觀察兩組RKO細(xì)胞的密度，置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜；細(xì)胞貼壁后吸除培養(yǎng)液，每孔中加入5.0 g/L的MTT 20 μL；培養(yǎng)4 h后徹底吸除培養(yǎng)液，每孔加入100 μL的DMSO，然后振蕩5 min，用酶標(biāo)儀于波長490 nm處檢測各接種板的吸光度(A)值；實(shí)驗(yàn)連續(xù)測定5 d，重復(fù)3次。

1.2.4克隆形成實(shí)驗(yàn) 將處于對(duì)數(shù)生長期的兩組細(xì)胞以2.5 g/L的胰酶消化，完全培養(yǎng)基重懸成細(xì)胞懸液，并以1 000個(gè)細(xì)胞/孔接種于用6孔板培養(yǎng)板中，每隔3 d進(jìn)行換液并觀察細(xì)胞狀態(tài)，在培養(yǎng)箱中持續(xù)培養(yǎng)8 d，吸除培養(yǎng)液；每孔加入體積分?jǐn)?shù)為0.04的多聚甲醛1 mL，固定細(xì)胞30 min；每孔加入GIEMSA染液500 mL，染色20 min；用ddH2O洗滌細(xì)胞數(shù)次至洗脫液無色，晾干、拍照、克隆計(jì)數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5Celigo細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測 將上述的兩組細(xì)胞以2.5 g/L胰酶消化，完全培養(yǎng)基重懸成細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)；以1 000個(gè)細(xì)胞/孔接種到96孔培養(yǎng)板上，然后于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜；通過Celigo儀器檢測讀板1次，連續(xù)檢測讀板5 d；對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)繪圖，繪制出5 d的細(xì)胞生長曲線。

1.2.6細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)檢測 將兩組細(xì)胞接種到6孔板上，細(xì)胞覆蓋率達(dá)到80%時(shí)以2.5 g/L的胰酶消化，離心后收集細(xì)胞；用4 ℃預(yù)冷的D-Hanks(pH 7.2)洗滌后，離心；以4 ℃的含體積分?jǐn)?shù)0.75乙醇固定細(xì)胞1 h后離心并洗滌細(xì)胞沉淀；加入PI細(xì)胞染液500 μL重懸，37 ℃孵育30 min，通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。

2 結(jié) 果

2.1 SAPCD2在各組織中的表達(dá)

與結(jié)直腸正常黏膜組織相比，SAPCD2在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)明顯增高(圖1)。結(jié)直腸癌組織中SAPCD2的表達(dá)與正常黏膜組織、腺瘤組織比較，差異有顯著性(Z=-7.377、-6.204，P<0.01)；而在相對(duì)正常黏膜及腺瘤組織中的表達(dá)差異無顯著性。見表1。對(duì)13例匹配的結(jié)直腸相對(duì)正常黏膜、腺瘤及結(jié)直腸癌組織三組相關(guān)樣本分析，結(jié)果仍顯示，結(jié)直腸癌組織中SAPCD2的表達(dá)與正常黏膜組織、腺瘤組織比較，差異具有顯著性(χ2=14.170，P<0.05)。見表2。108例結(jié)直腸癌病人的臨床病理資料顯示，SAPCD2的表達(dá)與腫瘤的浸潤深度相關(guān)(χ2=6.402，P<0.05)。見表3。

表1 結(jié)直腸癌、正常黏膜組織與腺瘤組織中SAPCD2表達(dá)

組1與組2采用非參數(shù)Mann-Whitney檢驗(yàn)，組3采用非參數(shù)Wilcoxon檢驗(yàn)。

表2 正常黏膜、腺瘤與結(jié)直腸癌組織中SAPCD2的表達(dá)

采用非參數(shù)Friedman檢驗(yàn)。其中SAPCD2在正常黏膜與腺瘤組織的表達(dá)無顯著差異。

2.2 敲減SAPCD2后人結(jié)腸癌RKO細(xì)胞的增殖和克隆形成能力

經(jīng)shRNA慢病毒感染后，定量PCR檢測顯示，RKO細(xì)胞中SAPCD2 mRNA的表達(dá)水平明顯降低(t=9.030，P<0.05)。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，第3～5 d與shControl組相比，SAPCD2敲減后細(xì)胞的增殖速度明顯減慢(t=70.231～244.000，P<0.05)。見表4?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，shControl組及shSAPCD2組細(xì)胞克隆數(shù)分別為240±6、68±4，SAPCD2敲減后細(xì)胞形成克隆的數(shù)量顯著減少(t=142.558，P<0.05)。見圖2。Celigo實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，第2～5天，與shControl組相比較，SAPCD2敲減后細(xì)胞生長能力受到了明顯抑制(t=4.856～22.869，P<0.05)。見圖3、表5。

2.3 敲減SAPCD2對(duì)人結(jié)腸癌RKO細(xì)胞細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，SAPCD2敲減后，RKO細(xì)胞G1期構(gòu)成比為(59.18±0.32)%，S期構(gòu)成比為(21.92±0.31)%，G2/M期構(gòu)成比為(18.90±0.14)%；shControl組RKO細(xì)胞G1期的構(gòu)成比為(52.19±0.73)%，S期的構(gòu)成比為(29.88±0.82)%，G2/M期構(gòu)成比為(17.93±0.54)%。與shControl組相比，敲減SAPCD2后RKO細(xì)胞處于S期的細(xì)胞顯著減少(t=22.378，P<0.05)，處于G1期的細(xì)胞顯著增多(t=-26.368，P<0.05)。見圖4。

3 討 論

有研究表明，SAPCD2作為與細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)的新近發(fā)現(xiàn)的基因，只在腫瘤中表達(dá)而不在成人正常組織中表達(dá)，這種分子很可能是結(jié)直腸癌進(jìn)展過程中重要的潛在的標(biāo)記物，起到致癌基因的作用[2]。然而，SAPCD2對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和遷移能力的影響還存在爭議[2,10-12]。因此，我們對(duì)結(jié)直腸癌標(biāo)本及結(jié)腸癌細(xì)胞系進(jìn)行研究，探索SAPCD2在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用以及其對(duì)結(jié)腸癌RKO細(xì)胞增殖能力的影響。

表3結(jié)直腸癌組織中SAPCD2表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系(例(χ/%))

臨床病理參數(shù)nSAPCD2表達(dá)高表達(dá)低表達(dá)χ2值P值性別 男6345(71.4)18(28.6) 女4530(66.7)15(33.3)0.2810.596 年齡(歲) ≥509365(69.9)28(30.1) <501510(66.7)5(33.3)0.0630.801 腫瘤部位 近端結(jié)腸1815(83.3)3(16.7) 遠(yuǎn)端結(jié)腸9060(66.7)30(33.3)1.9640.161 黏液腺癌 有119(81.8)2(18.2) 無9766(68.0)31(32.0)0.3540.552 分化程度 中分化+高分化7951(64.6)28(35.4) 低分化2924(82.8)5(17.2)3.3120.069 臨床分期 Ⅰ+Ⅱ7250(69.4)22(30.6) Ⅲ+Ⅳ3625(69.4)11(30.6)0.000 1.000 浸潤深度 T1+T21811(61.1)7(38.9) T33127(87.1)4(12.9) T45937(62.6)22(37.3)6.402 0.041 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況 N07451(68.9)23(31.1) N12117(81.0)4(19.0) N2137(53.8)6(46.2)2.811 0.245遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況 M010573(69.5)32(30.5) M1 32(66.7)1(33.3)0.000 1.000

a、b：結(jié)直腸正常黏膜組織，分別為100、200倍；c、d：結(jié)直腸癌組織，分別為100、200倍。

表5 SAPCD2基因敲減對(duì)RKO細(xì)胞生長能力的影響

圖2 SAPCD2基因敲減對(duì)RKO細(xì)胞克隆形成能力的影響

圖3 SAPCD2基因敲減對(duì)RKO細(xì)胞生長能力的影響

圖4 SAPCD2基因敲減對(duì)RKO細(xì)胞細(xì)胞周期的影響

本研究結(jié)果顯示，與結(jié)直腸正常黏膜相比，SAPCD2在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)明顯增高，與相關(guān)的研究結(jié)果一致[2,10]。這說明SAPCD2的表達(dá)與結(jié)直腸癌的發(fā)生有著一定的關(guān)系，很可能是結(jié)直腸癌中一種新的潛在的標(biāo)記物，但先前研究并未對(duì)SAPCD2在腺瘤中的表達(dá)進(jìn)行深入探討。而本研究結(jié)果顯示，腺瘤中SAPCD2的表達(dá)與結(jié)直腸正常黏膜無明顯差異，但與結(jié)直腸癌的表達(dá)卻有顯著性差異，SAPCD2的高表達(dá)發(fā)生在腺瘤產(chǎn)生之后，因此SAPCD2有可能是腺瘤癌變的一個(gè)啟動(dòng)基因，在腺瘤中進(jìn)行SAPCD2的早期檢測或許可以在一定程度上預(yù)測結(jié)直腸癌變的發(fā)生。對(duì)于SAPCD2在結(jié)直腸腺瘤惡變中的預(yù)測價(jià)值，仍需要進(jìn)一步的研究。

SAPCD2與結(jié)直腸癌的臨床病理特征的相關(guān)性在不同的研究中結(jié)果尚存在差異。WENG等[10]的研究表明，SAPCD2在結(jié)直腸癌中的表達(dá)與病人年齡、性別、腫瘤的部位、腫瘤分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)；YUAN等[2]研究顯示，SAPCD2在結(jié)直腸癌中的表達(dá)只與腫瘤分化程度有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，SAPCD2的表達(dá)只與腫瘤的浸潤深度有關(guān)，而與病人年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移等無關(guān)。這些差異有可能是樣本人群年齡、性別分布、環(huán)境因素、檢測方法和樣本含量等的差異導(dǎo)致的，SAPCD2與臨床病理特征的相關(guān)性還需要大樣本量的研究進(jìn)一步證實(shí)。

目前SAPCD2在結(jié)直腸癌中的分子機(jī)制及相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路尚未闡明[13]。WENG等[10]研究發(fā)現(xiàn)，SAPCD2誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲依賴于上皮-間質(zhì)間的轉(zhuǎn)化，通過增強(qiáng)STAT5與EZH2、β-catenin間相互作用進(jìn)而加強(qiáng)對(duì)細(xì)胞的浸潤；同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)MiR-29a能夠通過抑制SAPCD2阻滯細(xì)胞周期進(jìn)而阻遏胃癌細(xì)胞的增殖[8]。YUAN等[2]研究認(rèn)為，MiR-29a作為抑癌基因，在腫瘤中的表達(dá)普遍下調(diào)，在胃癌中可以通過抑制SAPCD2阻滯細(xì)胞周期，因此在結(jié)直腸癌中也可能通過抑制SAPCD2進(jìn)而抑制細(xì)胞的增殖和侵襲。而且相關(guān)的研究發(fā)現(xiàn)，SAPCD2在胃癌細(xì)胞G1期和M期的表達(dá)明顯增高，在G2期和S期的表達(dá)迅速減少[7,9]；MAO等[4]研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SAPCD2在NIH3T3細(xì)胞G1早期和M期大量表達(dá)，在G1晚期、S期和G2期表達(dá)減少。本研究結(jié)果顯示，敲減SAPCD2后G1期細(xì)胞顯著增多，而S期的細(xì)胞顯著地減少，說明敲減了SAPCD2可顯著抑制人結(jié)腸癌RKO細(xì)胞的細(xì)胞周期中G1/S期的轉(zhuǎn)換。細(xì)胞周期是細(xì)胞增殖與生長的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因素，因此提示SAPCD2不僅能導(dǎo)致細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，并能促進(jìn)有絲分裂的加速和染色體的分離[4]。但XIONG等[11]研究顯示，結(jié)直腸癌上皮-間質(zhì)間的轉(zhuǎn)化與STAT3、ZEB1的下調(diào)等有關(guān)，敲除STAT3可明顯增加E-cadherin水平，同時(shí)降低N-cadherin，從而抑制結(jié)直腸癌中細(xì)胞侵襲性；而WENG等[10]認(rèn)為，STAT3的敲除對(duì)SAPCD2沒有任何影響。因此，SAPCD2在結(jié)直腸癌中的分子機(jī)制及相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，SAPCD2的表達(dá)與結(jié)直腸癌的發(fā)生有著一定的關(guān)系，很可能是結(jié)直腸癌中一種新的潛在的標(biāo)記物；SAPCD2在腺瘤與結(jié)直腸癌中表達(dá)的顯著差異說明其有可能是腺瘤癌變的一個(gè)啟動(dòng)基因，在腺瘤中檢測SAPCD2的表達(dá)情況或許可以在一定程度上預(yù)測腺瘤惡變的發(fā)生。另外，本研究通過體外細(xì)胞系實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步證明，沉默SAPCD2可以抑制結(jié)腸癌RKO細(xì)胞的增殖能力。這些結(jié)果都說明SAPCD2在結(jié)直腸癌進(jìn)展過程中扮演著重要的角色。