鄒湘渝　曾琴　劉萍

【摘要】 目的：探討?zhàn)ぶ呒っ福╢ocal adhesion kinase ，F(xiàn)AK）抑制劑TAE226對(duì)人舌鱗狀細(xì)胞癌（tongue squamous cell carcinoma，TSCC）細(xì)胞株Tca8113中波形蛋白（Vimentin）的表達(dá)是否有抑制作用及其意義。方法：FAK抑制劑TAE226作用于Tca8113細(xì)胞，分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)Vimentin mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果：與對(duì)照組比較，Vimentin mRNA的相對(duì)表達(dá)量均顯著下降，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)上Vimentin mRNA的表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P <0.05），并呈現(xiàn)出劑量-效應(yīng)依賴性與時(shí)間-效應(yīng)依賴性（P<0.05）。當(dāng)TAE226作用72 h時(shí)，0.5 μmol /L組、1 μmol/L組、5 μmol/L組和10μ mol/L組的Vimentin mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別是對(duì)照組的0.51倍、0.41倍、倍、0.24倍和0.12倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：TAE226可以抑制舌鱗癌細(xì)胞株Tca8113中Vimentin的表達(dá)，這可能在TAE226抑制人舌鱗癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中扮演重要角色。

【關(guān)鍵詞】 TAE226； 黏著斑激酶； 舌鱗狀細(xì)胞癌； 波形蛋白

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2018.18.004 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1674-6805（2018）18-000-03

The Expression of Vimentin in Human Tongue Squamous Cell Carcinoma Cells Acted by Focal Adhesion Kinase Inhibitor TAE226/ZOU Xiangyu，ZENG Qin，LIU Ping，et al.//Chinese and Foreign Medical Research，2018，16（18）：-11

【Abstract】 Objective：To study whether TAE226（a focal adhesion kinase inhibitor） could inhibit the expression of Vimentin in human tongue squamous cell carcinoma cell line Tca8113 and its significance.Method：Tca8113 cells were cultured with TAE226.On hour 24，48，72，RT-PCR was conducted to detect the expression of Vimentin.Result：Compared to the control group，the expression level of Vimentin in the experimental groups decreased（P<0.05）.The relative expression differences of the experimental groups and control groups at all time points showed statistically significant（P<0.05）.When TAE226 worked 72 h，the relative expressions of Vimentin in 0.5 μmol/L group，1 μmol/L group，5 μmol/L group and 10 μmol /L group had dropped 0.51 times，0.41 times，0.24 times and 0.12 times respectively（P<0.05）.Conclusion：TAE226 can effectively inhibit the expression of Vimentin in human tongue cell line Tca8113，which may play an important role in the invasion and metastasis of TAE226 inhibiting human tongue squamous cell carcinoma.

【Key words】 TAE226； Focal adhesion kinase； Tongue squamous cell carcinoma； Vimentin

First-authors address：The Hospital of Stomatology Southwest Medical University，Luzhou 646000，China

口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma， OSCC，簡(jiǎn)稱口腔鱗癌）是口腔頜面部最常見(jiàn)的惡性腫瘤，同時(shí)也是世界第六常見(jiàn)的惡性腫瘤，是世界范圍內(nèi)癌癥發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一[1]。局部浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是OSCC難治性與致死性的根本原因，因此阻斷癌前病變突破基底膜轉(zhuǎn)化為浸潤(rùn)癌（即侵襲生長(zhǎng)），是實(shí)現(xiàn)口腔鱗癌早期防治的關(guān)鍵。TAE226是一種二苯胺基吡啶化合物，是目前公認(rèn)的針對(duì)黏著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）的ATP競(jìng)爭(zhēng)性酪氨酸激酶抑制劑，可以有效阻斷FAK信號(hào)通路。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)TAE226能抑制口腔癌、卵巢癌、食管癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、人神經(jīng)母細(xì)胞瘤等多種惡性腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力及血管生成[2-3]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)定量RT-PCR法檢測(cè)TAE226作用于人舌鱗癌Tca8113細(xì)胞后波形蛋白（vimentin） mRNA的表達(dá)變化并探討其意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

Tca8113細(xì)胞株，西南醫(yī)科大學(xué)口頜面修復(fù)重建和再生實(shí)驗(yàn)室提供；TAE226，Selleck 上海藍(lán)木化工有限公司；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，北京索萊寶生物科技有限公司；RPMI1640培養(yǎng)液，賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司；PBS，北京索萊寶生物科技有限公司；DMSO，美國(guó)AMRESCO；RNA提取試劑盒，TIANGEN生化科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑，日本TOYOBO公司；QuantiFast ?SRBR? Green PCR Kit，德國(guó)QIAGEN公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 TAE226的配制及實(shí)驗(yàn)分組 將TAE226溶解于DMSO 20 mmol/L（在Z-VAD-FMK試管中加入107 μl的DMSO，稀釋成20 mmol/L液體），于-20 ℃冰箱中分裝保存。臨用前按比例稀釋。本實(shí)驗(yàn)將配制成TAE226終濃度為0.5、1、5、10 μmol/L的培養(yǎng)液作為實(shí)驗(yàn)組，配制含相同體積比例的DMSO的培養(yǎng)液為對(duì)照組。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè) Tca8113細(xì)胞株由含10%胎牛血清、青霉素100 μg/ml、鏈霉素100μg/ml及RPMI-1640培養(yǎng)基配制的培養(yǎng)液于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。Tca8113細(xì)胞按5×105/ml的密度接種于六孔板，待細(xì)胞完全貼壁后，去除廢液，PBS沖洗，并分別加入TAE226（0、0.5、1、5、10μmol/L）的培養(yǎng)液3 ml/孔，搖勻，置于孵箱中培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)24、48、72 h后，按試劑盒說(shuō)明書裂解細(xì)胞提取總RNA，并于微量分光光度計(jì)上檢測(cè)RNA純度及濃度，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA并擴(kuò)增Vimentin RNA。反應(yīng)體系：總RNA模板2 ?l

（1 ?g），蒸餾水6.4 μl，?SRBR? Green Real time PCR Master Mix 10 ?l，上游引物0.8 μl，下游引物0.8 μl。設(shè)置三個(gè)復(fù)孔，擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性，30 s；95 ℃變性30 s；57 ℃退火10 s；72 ℃延伸15 s，共40個(gè)循環(huán)。RT-PCR引物由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)并合成，見(jiàn)表1。以目的基因的相對(duì)表達(dá)量=2-ΔΔCT計(jì)算出各基因的相對(duì)表達(dá)水平，其中ΔCt=CT（目的基因）-CT（內(nèi)參基因），ΔΔCt=ΔCT（實(shí)驗(yàn)組）-ΔCT（對(duì)照組）。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。計(jì)量資料以（x±s）表示，多組間比較采用重復(fù)變量方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

與對(duì)照組比較，加入TAE226后，Vimentin mRNA的相對(duì)表達(dá)量都顯著下降，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)上mRNA的表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），呈現(xiàn)出劑量-效應(yīng)依賴性與時(shí)間-效應(yīng)依賴性（P<0.05）。取各對(duì)照組Vimentin mRNA的相對(duì)表達(dá)量為1，則10 μmol/L組mRNA的表達(dá)均低于5 μmol/L組、1 μmol/L組、0.5 μmol /L組（P<0.05），且72 h 10μmol/L組的Vimentin mRNA較對(duì)照組下降了約0.12倍（P<0.05），見(jiàn)圖1和表2。

3 討論

口腔鱗狀細(xì)胞癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，而舌鱗狀細(xì)胞癌，簡(jiǎn)稱舌鱗癌又是最常見(jiàn)的口腔頜面部惡性腫瘤[4]，其生物學(xué)行為惡劣，早期即可發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重威脅著人類健康[5]。腫瘤轉(zhuǎn)移為受多種促轉(zhuǎn)移基因和轉(zhuǎn)移抑制基因調(diào)控的復(fù)雜過(guò)程，其中腫瘤細(xì)胞侵襲是腫瘤轉(zhuǎn)移的前提，有必要對(duì)其相關(guān)分子機(jī)制進(jìn)行深入研究。FAK是一種非受體型酪氨酸蛋白激酶，是細(xì)胞內(nèi)重要的骨架蛋白與多種信號(hào)通路的關(guān)鍵分子。它在整合生長(zhǎng)和細(xì)胞基質(zhì)黏附信號(hào)方面具有關(guān)鍵作用，是癌癥侵襲和轉(zhuǎn)移的主要驅(qū)動(dòng)力[6-7]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AK在口腔鱗癌中高表達(dá)，且與口腔鱗癌的侵襲能力呈正相關(guān)關(guān)系，目前已成為研究抗腫瘤藥物的重要靶點(diǎn)之一。而TAE226是目前發(fā)現(xiàn)的一種針對(duì)FAK的強(qiáng)效抑制劑[7]。Kurio等[8]研究發(fā)現(xiàn)TAE226可抑制人類口腔鱗狀細(xì)胞癌SAS細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，且經(jīng)TAE226處理后的口腔鱗癌細(xì)胞伴有肌動(dòng)蛋白纖維和細(xì)胞黏附喪失。Vimentin是一種進(jìn)化上保守的中間纖維蛋白，人類波形蛋白的編碼基因位于染色體10p13，作為一種重要的骨架蛋白維持細(xì)胞的完整性，與細(xì)胞骨架構(gòu)成和細(xì)胞黏附密切相關(guān)。波形蛋白是間質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物，主要表達(dá)于間充質(zhì)，在正常上皮組織中并不表達(dá)[9]。但近年研究發(fā)現(xiàn)波形蛋白在上皮來(lái)源的腫瘤如乳腺癌、肝癌、腎上腺癌、胃癌、直腸癌、宮頸癌等中異常表達(dá)，并參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程[10]，因此通過(guò)分子生物學(xué)的方法阻止腫瘤中波形蛋白的過(guò)表達(dá)降低腫瘤的侵襲性，從而為腫瘤的分子靶向治療開(kāi)辟了一條新道路。

本課題組前期研究中發(fā)現(xiàn)，1μmol/L TAE226對(duì)Tca8113細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲已有明顯的抑制效果，在本實(shí)驗(yàn)中，TAE226作用下的人舌鱗癌Tca8113細(xì)胞中間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin mRNA表達(dá)下降，且TAE226劑量越大，作用時(shí)間越長(zhǎng)，Vimentin mRNA的相對(duì)表達(dá)量則越低，TAE226抑制了人舌鱗癌細(xì)胞中Vimentin的表達(dá)。有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤在侵襲轉(zhuǎn)移的過(guò)程中，Vimentin可表達(dá)在上皮源性的腫瘤細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，賦予了上皮源性細(xì)胞成纖維細(xì)胞樣的特征，使細(xì)胞更易于遷移和運(yùn)動(dòng)，細(xì)胞之間黏附連接能力下降，遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)，發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變（EMT），后者是癌變侵襲轉(zhuǎn)移的首要步驟，嚴(yán)重影響病變的預(yù)后，因此Vimentin已經(jīng)成為上皮源性腫瘤預(yù)后的重要指標(biāo)[11-12]。因此，可以推測(cè)TAE226抑制Vimentin的表達(dá)，降低細(xì)胞遷移和運(yùn)動(dòng)能力，增強(qiáng)細(xì)胞的黏附能力，進(jìn)而抑制細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。

綜上所述，TAE226，作為FAK的強(qiáng)效抑制劑之一，能抑制人舌鱗癌細(xì)胞中Vimentin的表達(dá)，這可能在TAE226抑制舌鱗癌細(xì)胞的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中起著重要作用。由于腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制十分復(fù)雜，本課題組將在波形蛋白及EMT信號(hào)通路方面進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究以探討TAE226的抗腫瘤機(jī)制，為進(jìn)一步探索口腔腫瘤的防治策略提供參考。

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（收稿日期：2018-01-19）