李鉉軍，張先，付長(zhǎng)雪，李范洙

摘要：為探究枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵人參對(duì)人參內(nèi)稀有皂苷Rg3含量的影響，本實(shí)驗(yàn)首先以七葉苷修飾過(guò)的LB營(yíng)養(yǎng)瓊脂為選擇培養(yǎng)基，從大醬中分離得到的200株枯草芽孢桿菌菌株中篩選出10株產(chǎn)β葡萄糖苷酶的枯草芽孢桿菌。然后用pNPG法分別測(cè)得10種菌種產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的酶活力，選取酶活力最高的58號(hào)菌進(jìn)行培養(yǎng)，并對(duì)58號(hào)菌的最適產(chǎn)酶條件進(jìn)行研究，得到58號(hào)菌的最佳培養(yǎng)時(shí)間為16 h，最適產(chǎn)酶溫度36℃，最適產(chǎn)酶pH值6.0，最佳產(chǎn)酶時(shí)間8 h。在最適條件下，用58號(hào)菌對(duì)雙螺桿擠壓后的人參進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，以白參為參照。結(jié)果表明在第4d時(shí)，白參內(nèi)Rg3含量最高，為0.6236 mg/g，比發(fā)酵前提高了53.75%。在第4d時(shí)，雙螺桿擠壓后的人參內(nèi)Rg3含量最高，為0.8442 mg/g，比發(fā)酵前提高了70.99%。

關(guān)鍵詞：枯草芽孢桿菌；人參；Rg3

中圖分類號(hào)： R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A DOI編號(hào)： 10.14025/j.cnki.jlny.2018.18.026

人參為五加科人參屬多年生草本植物。是一種傳統(tǒng)的名貴中草藥，在我國(guó)具有悠久的藥用歷史，被譽(yù)為“百草之王”。《神農(nóng)本草經(jīng)》是現(xiàn)存最早的中藥學(xué)專著，據(jù)其記載人參具有“補(bǔ)五臟、安精神、定魂魄、止驚悸、除邪氣、明目益智，久服輕身延年”之功效。人參中的主要活性成分之一是人參皂苷，已知的人參皂苷有40余種。白參中含量最高的人參皂苷為Rb1、Rb2、Rd、Rg1、Re、Rf等[1]。紅參含量高的二醇類皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd 等， 加工過(guò)程中轉(zhuǎn)化為Rg3 、Rg5、Rh2、Rh3 等稀有皂苷；含量高的三醇類皂苷Rg1、Re、Rf 等， 轉(zhuǎn)化為Rg2、Rg4 、Rh1、Rh4 等稀有皂苷[2]。這些稀有皂苷具有很高的生理活性，尤其在抗腫瘤方面顯示了獨(dú)特的作用，但是其人參內(nèi)含量普遍很低。為此，本實(shí)驗(yàn)致力于研究微生物法固態(tài)發(fā)酵人參以增加其內(nèi)稀有皂苷Rg3、Rd的含量。

多年來(lái)，各國(guó)科學(xué)研究者圍繞人參單體皂苷制備，從化學(xué)法[3]、組織培養(yǎng)法、人參發(fā)根誘導(dǎo)培養(yǎng)法、酶法[4]、微生物發(fā)酵法等方面進(jìn)行了探索，并在某些方面取得了進(jìn)展，但目前大多停留在實(shí)驗(yàn)室階段。微生物發(fā)酵是利用微生物細(xì)胞產(chǎn)生的一種或多種酶將外源底物進(jìn)行催化使其轉(zhuǎn)變成結(jié)構(gòu)相關(guān)的經(jīng)濟(jì)價(jià)值更高的產(chǎn)物，這是物理或化學(xué)方法難以實(shí)現(xiàn)的生化反應(yīng)。微生物發(fā)酵法主要包括液體發(fā)酵和固體發(fā)酵兩種。液體發(fā)酵是將底物人參皂苷從生藥中提取出來(lái)，在液體環(huán)境下利用微生物產(chǎn)生水解酶進(jìn)行的發(fā)酵方法。固體發(fā)酵工藝是指在幾乎沒(méi)有自由水存在下，在有一定濕度的水不溶性固體基質(zhì)中，用一種或多種微生物發(fā)酵的生化反應(yīng)過(guò)程[5]。

人參皂苷的固體發(fā)酵是將人參等中藥材作為營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)，通過(guò)微生物的生理活動(dòng)與生化反應(yīng)過(guò)程對(duì)人參皂苷進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，產(chǎn)生新的生物活性成分和新的功能。這是一個(gè)雙向發(fā)酵的過(guò)程。具有活性成分的藥性基質(zhì)被微生物發(fā)酵，提供微生物維持生命所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)菌體生長(zhǎng)分裂。同時(shí)又能因菌體代謝產(chǎn)生的酶而改變?nèi)藚⒃碥盏脑薪Y(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)化為活性更高的稀有人參皂苷。近年研究者開始將藥用真菌或食用細(xì)菌作為發(fā)酵菌株對(duì)人參進(jìn)行雙向發(fā)酵。無(wú)須將微生物與發(fā)酵產(chǎn)物分離，二者共同發(fā)揮藥物活性，克服了其他皂苷轉(zhuǎn)化方法分離純化困難、產(chǎn)率低等缺點(diǎn)。工藝簡(jiǎn)單，質(zhì)量易于控制，次級(jí)人參皂苷含量豐富，適宜工業(yè)化生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)原料為白參和雙螺桿擠壓后的人參，所用菌種來(lái)自于從朝鮮族大醬中提取出的200株枯草芽孢桿菌。

1.2 試劑與藥品

對(duì)硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（上海晶純生化科技股份有限公司）；

七葉苷（上海源葉生物科技有限公司）；

LB營(yíng)養(yǎng)瓊脂（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；

LB營(yíng)養(yǎng)肉湯（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；

其余乙酸、乙酸鈉、對(duì)硝基苯酚、碳酸鈉，無(wú)水正丁醇，無(wú)水甲醇（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）。

1.3 試驗(yàn)儀器

SW-CJ-1FD 超凈工作臺(tái)（上海新苗醫(yī)療器械機(jī)械制造有限公司）；

SX-700 高壓蒸汽滅菌鍋（日本TOMY公司）；

NU-9668E 超低溫冷凍箱（美國(guó)NUAIRE公司）；

JA-3100 精密電子天平（深美儀器有限公司）；

FA1004 電子天平（上海良平儀器儀表有限公司）；

DHG-907385-Ⅲ 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）；

KQ-500DE 醫(yī)用數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；

HH-8 數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市科析儀器有限公司）；

TDL-5000B 冷凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；

DZF-6050 真空干燥箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）；

SHB-ⅢA 循環(huán)水式多用真空泵（上海豫康科技儀器設(shè)備有限公司）；

UV-1800 紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司）；

40目網(wǎng)篩。

1.4 菌種的活化和篩選

1.4.1 枯草芽孢桿菌的活化：采用劃線法[6] 制作平板在超凈工作臺(tái)中將滅菌后的LB營(yíng)養(yǎng)趁熱傾倒在無(wú)菌培養(yǎng)皿中。水平在滅菌后的工作臺(tái)上，冷凝后加蓋保存；菌體培養(yǎng)：將200株菌種從冷藏箱中取出后，在超凈工作臺(tái)中劃線接入平板中，在37℃培養(yǎng)24h于恒溫培養(yǎng)箱中；菌種活化：將200個(gè)菌種繼代培養(yǎng)3次，進(jìn)行純化。

1.4.2 產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株的篩選 將200株枯草芽孢桿菌分別接種在添加了七葉苷和檸檬酸鐵的LB營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板中，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。七葉苷顯色的原理為：七葉苷在β-葡萄糖苷酶的作用下能夠水解為七葉苷元（6，7-二輕香豆素）和葡萄糖，當(dāng)七葉苷元遇到游離的鐵離子時(shí)會(huì)產(chǎn)生黑色物質(zhì)[7-8]。借此篩選出能夠產(chǎn)生葡糖苷酶的菌株。

1.4.3 對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確稱取對(duì)硝基苯酚1.39mg，溶解于蒸餾水中并定容至100mL。取 6個(gè)10mL容量瓶，分別吸取 1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL 對(duì)硝基苯酚溶液至 1～6 號(hào)瓶，用蒸餾水定容并混勻。則1～6 號(hào)瓶對(duì)應(yīng)的對(duì)硝基苯酚濃度為0.01mmol/L、0.02mmol/L、0.03mmol/L、0.04mmol/L、0.05mmol/L、0.06mmol/L。

分別取不同濃度的對(duì)硝基苯酚溶液2mL，再加入1mL 1mol/L碳酸鈉溶液充分混勻，以蒸餾水為對(duì)照，紫外分光光度計(jì)在40nm的條件比色記錄值，橫坐標(biāo)為對(duì)硝基苯酚的濃度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.4 β-葡萄糖苷酶活性測(cè)定 β-葡萄糖苷酶活性測(cè)定采用pNPG法[9-10]，pNPG法是以對(duì)硝基苯酚-β-葡萄糖苷為底物，β-葡萄糖苷酶可以在酸性條件下使其水解生成對(duì)硝基苯酚，對(duì)硝基苯酚在堿性條件下為黃色，后用比色法測(cè)定并計(jì)算出β-葡萄糖苷酶活力。

取0.1mL粗酶液，加入0.9mL pH 5.0的0.2mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，于37℃水浴預(yù)熱，10分鐘后加入已預(yù)熱10 min的1mL 5 mmol/L pNPG溶液，精確計(jì)時(shí)10min后立即加入1mL 1mol/L 碳酸鈉溶液終止反應(yīng)，室溫放置5min冷卻，于400nm處測(cè)吸光值OD。以加熱失活的酶液為空白對(duì)照。

在此條件下，酶的活性（U）被定義為酶每分鐘分解pNPG 釋放出 1 mol 對(duì)硝基苯酚所需要的酶量。

1.5 枯草芽孢桿菌酶學(xué)性質(zhì)研究[11-12]

1.5.1 枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線的確定 將枯草芽孢桿菌液體培養(yǎng)12h后，制成種子液。吸取1ml種子液接種于裝有50mL LB肉湯的錐形瓶中，搖勻后置于37℃培養(yǎng)24h，以未接種的培養(yǎng)基為空白對(duì)照，每隔4h在600nm處測(cè)定培養(yǎng)液的吸光度值。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線。

1.5.2 枯草芽孢桿菌產(chǎn)β-葡萄糖苷酶最佳培養(yǎng)時(shí)間的確定

分別吸取1mL種子液于8組裝有25mL LB肉湯的錐形瓶中搖勻，pH自然，密封在37℃條件下恒溫?fù)u床培養(yǎng)。分別在0h、4h、8h、12h、16h、20h、24h時(shí)，將培養(yǎng)液于無(wú)菌離心試管中，在4000 r/min下離心10min，制得粗酶液，測(cè)定酶活。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.5.3 枯草芽孢桿菌產(chǎn)β-葡萄糖苷酶最佳培養(yǎng)pH的確定

分別吸取1mL種子液于9組裝有25mL LB肉湯的錐形瓶中，調(diào)節(jié)LB肉湯pH值分別為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，在37℃條件下恒溫?fù)u床培養(yǎng)24h。后將培養(yǎng)液于無(wú)菌離心試管中，在4000r/min下離心10min，制得粗酶液，測(cè)定酶活。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.5.4 枯草芽孢桿菌產(chǎn)β-葡萄糖苷酶最佳培養(yǎng)溫度的確定

分別吸取1mL種子液于6組裝有25mL LB肉湯的錐形瓶中，pH自然，在28℃、31℃、34℃、37℃、40℃、43℃下?lián)u床培養(yǎng)24h后，將培養(yǎng)液于無(wú)菌離心試管中，在4000r/min下離心10min，制得粗酶液，測(cè)定酶活。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.6 人參固態(tài)發(fā)酵及稀有皂苷測(cè)定

1.6.1 枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵人參 取活化后的枯草芽孢桿菌1mL接種至20mL LB肉湯培養(yǎng)基中，以36℃、150rpm/min條件下恒溫?fù)u床中培養(yǎng)16h，制成種子液；將雙螺桿擠壓后的人參和白參粉碎后過(guò)40目篩；取過(guò)篩后的人參4g加5mL LB肉湯培養(yǎng)基混合均勻后置于高壓滅菌鍋中，滅菌處理；冷卻后，加入0.25mL種子液，密封后置于36℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～5天，每隔24h測(cè)定一次人參皂苷；實(shí)驗(yàn)分為十組，雙螺桿擠壓后的人參五組，白參五組，各組三個(gè)平行。

1.6.2 稀有人參皂苷Rg3的提取與檢測(cè)[13-17]

將發(fā)酵后的人參從培養(yǎng)箱中取出，干燥后，研磨成均勻顆粒大小，過(guò)40目篩；稱取2g發(fā)酵人參粉放入平底燒瓶，加入80%甲醇溶液，在80℃下回流提取3h，取上清液，此操作重復(fù)兩次；所得提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓回收甲醇（溫度不超過(guò)60℃）；減壓回收后，浸膏掛于燒瓶?jī)?nèi)部，加20mL蒸餾水溶解；所得水溶液再加20mL水飽和正丁醇溶液，置于離心管中；在4000rpm下離心萃取10min，重復(fù)三次，取上清液并合并；將所得上清液在60℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，減壓回收正丁醇液，蒸干后殘留物即為總皂苷粗品；在旋干后的燒瓶中加入2mL甲醇溶液溶解，過(guò)濾，得待測(cè)樣品；HPLC法[18]測(cè)定皂苷含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的菌株篩選

在枯草芽孢桿菌進(jìn)行產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的菌株篩選時(shí)，菌落周圍出現(xiàn)黑色水解斑的菌株為最終的目的菌。篩選結(jié)果如下圖 1 所示，200株中有10株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶。

結(jié)果如圖1所示，200株枯草芽孢桿菌中在七葉苷選擇培養(yǎng)基下共篩出10株顯色菌株，1、58、153三株顯色較深，其余6株顯色較淺，剩余191株不顯色。

2.2 對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)1.4.4中的方法，酶活力計(jì)算公式為：U=C×N/（10×0.1）

注：U：酶活力（IU/mL） 10：反應(yīng)時(shí)間（min）

N：原酶液稀釋倍數(shù) 0.1：添加酶液體積（mL）

C：對(duì)硝基苯酚含量，為對(duì)硝基苯酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線上的值，見(jiàn)圖2。

根據(jù)上圖的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為：y=10.834x+0.0155，相關(guān)系數(shù) R2=0.9989（y為對(duì)硝基苯酚的吸光度，x為對(duì)硝基苯酚的濃度）。

2.3 不同菌株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶活力測(cè)定結(jié)果

對(duì)10株篩選后的菌株進(jìn)行β-葡萄糖苷酶活力測(cè)定結(jié)果如圖3所示：

由圖3可知，第58號(hào)菌株為產(chǎn)β-葡萄糖苷酶活力最高的菌株，因此選擇58號(hào)菌為人參固態(tài)發(fā)酵的發(fā)酵菌株。

2.4 枯草芽孢桿菌酶學(xué)性質(zhì)研究

2.4.1 枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)曲線

由圖4可知，58號(hào)枯草芽孢桿菌在4～8h為生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，繁殖速度最快；在12h后趨于穩(wěn)定，此時(shí)繁殖速度與死亡速度幾乎持平；而16h后，由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及生長(zhǎng)空間的匱乏，細(xì)菌數(shù)急速下降，繁殖速度滯后，死亡率升高。

2.4.2 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)枯草芽孢桿菌產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的影響 由于酶的產(chǎn)量會(huì)受菌液培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)短的影響，所以在37℃下，對(duì)菌液進(jìn)行恒溫?fù)u瓶培養(yǎng)。分別在0h、4h、8h、12h、16h、20h、24h時(shí)，對(duì)菌液進(jìn)行搖勻離心，測(cè)定其酶活力，以最高酶活100%計(jì)算。結(jié)果如圖5所示：

由圖5可知，枯草芽孢桿菌在0～4h時(shí)酶活力緩慢增加；4～8h時(shí)產(chǎn)酶量迅速增加，酶活力增長(zhǎng)速度快；在8h時(shí)達(dá)到產(chǎn)酶量的峰值；繼續(xù)培養(yǎng)后，酶活性開始逐漸下降。

2.4.3 pH值對(duì)枯草芽孢桿菌產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的影響 不同來(lái)源菌株其最適pH值是不同的，只有在特定的pH值范圍內(nèi)才會(huì)表現(xiàn)出最大活性，即為所謂的最適pH值。在不同pH值條件下對(duì)菌液進(jìn)行恒溫培養(yǎng)，測(cè)定酶活力。酶活以最高100%計(jì)算。結(jié)果如圖6所示：

由圖6所知，菌株在pH為7.0時(shí)，酶活力最強(qiáng)。在pH值低于7.0的條件下，酶活性隨著pH值的提高而增強(qiáng)；在pH值高于7.0的情況下，酶活性隨著pH值的升高而減弱。

2.4.4 溫度對(duì)枯草芽孢桿菌產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的影響 每一種酶在一定條件下，只在某一特定溫度時(shí)才表現(xiàn)出最大的活性，即所謂的最適溫度。溫度和pH值對(duì)酶的活性的影響是相互依賴的[9]。所以，反應(yīng)必須控制在恒溫條件下進(jìn)行，且所有試劑應(yīng)預(yù)熱到所需要的溫度。本實(shí)驗(yàn)將菌液pH調(diào)至7.0，分別考察菌液在28℃、31℃、34℃、37℃、40℃、43℃下酶活力的變化。酶活以最高為100%計(jì)算。結(jié)果如圖7所示：

由圖7所知，菌株在反應(yīng)溫度為37℃時(shí)，酶活性達(dá)到峰值。在低于此溫度條件下，酶活性隨著反應(yīng)溫度的升高而增強(qiáng)；在高于此溫度條件時(shí)，酶活性則隨著反應(yīng)溫度的升高而減弱。

2.5 人參內(nèi)稀有皂苷Rg3的含量及分析

為了研究枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵人參對(duì)人參內(nèi)稀有皂苷Rg3含量的影響，在發(fā)酵菌最適產(chǎn)酶條件下，對(duì)處理后的人參粉進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，并且每隔24h對(duì)其進(jìn)行稀有皂苷含量的測(cè)定，最終比較人參發(fā)酵前后人參內(nèi)Rg3含量的變化情況。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法測(cè)量Rg3的含量，原料為雙螺桿擠壓后的人參，白參為對(duì)比參照。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1和圖8所示：

由表1和圖8可得，雙螺桿擠壓后的人參中Rg3的含量一直高于普通白參，未發(fā)酵時(shí)提高了20.56%，發(fā)酵后提高了35.38%，說(shuō)明雙螺桿擠壓后的人參在發(fā)酵時(shí)更有利于Rg3的生成，從而導(dǎo)致在發(fā)酵后Rg3含量增加。

由表1和圖8可知，雙螺桿擠壓后的人參在發(fā)酵第四天時(shí)，Rg3含量最高，相比較發(fā)酵前Rg3含量提高70.99%。雙螺桿擠壓后的人參在發(fā)酵的第1～4d，Rg3的含量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，在第四天含量達(dá)到峰值，從第五天開始，Rg3的含量開始隨時(shí)間增加而減少。白參同樣在發(fā)酵的第四天時(shí)，Rg3含量到達(dá)峰值，與發(fā)酵前含量相比較提高了58.75%。白參內(nèi)Rg3含量在發(fā)酵的1～4d呈上升趨勢(shì)，第五天開始有所下降。

人參在發(fā)酵過(guò)程中均出現(xiàn)了發(fā)酵的1～2d時(shí)Rg3含量低于未發(fā)酵時(shí)，經(jīng)過(guò)2d發(fā)酵后，人參內(nèi)Rg3含量開始急速上升直至超過(guò)發(fā)酵前人參內(nèi)Rg3含量的現(xiàn)象。在王洪峰[20]等對(duì)人參雙向發(fā)酵過(guò)程中總皂苷和總多糖含量的研究中，人參皂苷Rb1的C20位置處的糖苷鍵會(huì)在發(fā)酵過(guò)程水解斷裂變成Rg3，從而使Rg3含量增加。陳[13]等在枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)化人參總苷為Rg3的研究中提出β-葡萄糖苷酶水解人參皂苷Rb1 C20位點(diǎn)處的葡萄糖苷，形成Rg3和1分子葡萄糖，最終使Rg3含量增加。對(duì)于發(fā)酵第1天出現(xiàn)Rg3含量低于發(fā)酵前的情況，猜測(cè)發(fā)酵前期細(xì)菌生長(zhǎng)需要大量營(yíng)養(yǎng)物，Rg3可能出現(xiàn)逆水解反應(yīng)生成營(yíng)養(yǎng)物以供細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖；細(xì)菌數(shù)穩(wěn)定后，β-葡萄糖苷酶開始發(fā)揮作用，此時(shí)Rg3含量開始快速增加，即發(fā)酵2～4d；隨著細(xì)菌數(shù)的增加，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)減少，細(xì)菌內(nèi)部出現(xiàn)競(jìng)爭(zhēng)生長(zhǎng)，此時(shí)可能又會(huì)出現(xiàn)Rg3的逆水解反應(yīng)，Rg3開始減少，細(xì)菌所需營(yíng)養(yǎng)物有所增加，即出現(xiàn)發(fā)酵第五天Rg3含量開始下降的現(xiàn)象。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)從200株枯草芽孢桿菌中篩選出10株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的菌株，隨后使用pNPG法分別測(cè)得此10個(gè)菌株的酶活力，并從中選取酶活力最高的58號(hào)菌株為最終發(fā)酵菌株。然后，對(duì)58號(hào)菌進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)研究，得出58號(hào)菌在培養(yǎng)8h后β-葡萄糖苷酶活性達(dá)到最高，產(chǎn)酶最適pH值為7.0，最適溫度為37℃。在枯草芽孢桿菌最適產(chǎn)酶條件下，對(duì)人參進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，最終得到在發(fā)酵第四天時(shí)，雙螺桿擠壓后的人參和白參中Rg3含量達(dá)到最高。發(fā)酵后，雙螺桿擠壓后的人參內(nèi)Rg3含量提高了70.99%，白參內(nèi)Rg3含量提高了53.75%。且發(fā)酵前，人參經(jīng)雙螺桿擠壓后Rg3含量提高了20.56%；發(fā)酵后，雙螺桿擠壓后的人參相較于白參Rg3含量提高了35.38%。

實(shí)驗(yàn)證明，枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵法提高了人參內(nèi)稀有皂苷Rg3含量。

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作者簡(jiǎn)介：李鉉軍，碩士，講師，研究方向：食品分析。

通訊作者：李范洙，朝鮮族，博士，副教授，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品深加工研究。