張海平,朱 月,韋玉龍,李 騰,于 寧,朱 寧,甘芝霖,孫愛東

(北京林業(yè)大學生物科學與技術(shù)學院,林業(yè)食品加工與安全北京市重點實驗室,北京 100083)

黑果腺肋花楸(Aroniamelanocarpa),又名野櫻莓、不老莓,薔薇科、多年生落葉灌木,原產(chǎn)于美國東北部地區(qū)[1]。20世紀90年代初,由前蘇聯(lián)及歐洲引入我國遼西地區(qū),開展黑果腺肋花楸的引進栽培和果實的加工研究[2]。

黑果腺肋花楸果實中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì),具有較高的營養(yǎng)價值和藥用價值,果實中富含維生素、有機酸、礦物質(zhì)和多酚類化合物等物質(zhì)[3]。對20種富含多酚類物質(zhì)的鮮果進行抗氧化能力研究發(fā)現(xiàn),黑果腺肋花楸清除自由基能力最強,顯著高于黑加侖等水果[4]。多酚類物質(zhì)是黑果腺肋花楸果實中重要的活性物質(zhì),黑果腺肋花楸果實中提取的多酚類物質(zhì)可以促進胰島素酶分泌,控制胰腺炎癥,調(diào)節(jié)血糖水平[5],且對乳房癌具有抑制作用[6]。黑果腺肋花楸提取物對于抗誘變和預防冠狀動脈疾病發(fā)揮積極作用[7-8]。

目前,國內(nèi)研究多集中于果實有效成分和功能性的研究,對于黑果腺肋花楸果實中多酚類物質(zhì)、花青素、原花青素等物質(zhì)的超聲輔助提取已有大量報道[9-11],但是將其果實加工為高附加值的產(chǎn)品較少,綜合利用較低,相關(guān)產(chǎn)品研發(fā)較少,市場鮮有以黑果腺肋花楸為原料而制成的產(chǎn)品,精深加工能力不足[12]。

黑果腺肋花楸果實中含有大量的單寧物質(zhì),鮮食及鮮榨果汁口感酸澀,不易直接食用,消費者接受程度低[13],但乳酸菌發(fā)酵能夠改善果蔬制品風味及口感,使得發(fā)酵香與果蔬香渾然一體。植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)是乳酸菌的一種,屬于乳桿菌科乳桿菌屬。植物乳桿菌相比于其他乳桿菌,優(yōu)勢在于此菌的活菌數(shù)較高,且在生長過程中能夠產(chǎn)生特有的具有防腐功能的生物型乳酸菌素[14]。

因此,本研究以黑果腺肋花楸為原料,利用植物乳桿菌發(fā)酵,并通過單因素和正交試驗對黑果腺肋花楸發(fā)酵飲料的發(fā)酵條件進行優(yōu)化,以確定最佳發(fā)酵條件,為黑果腺肋花楸發(fā)酵飲料的開發(fā)提供理論依據(jù),為黑果腺肋花楸綜合利用開拓新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑果腺肋花楸 吉林省延邊市;植物乳桿菌C8-1 北京林業(yè)大學生物科學與技術(shù)學院食品系張柏林老師贈與;MRS培養(yǎng)基 北京奧博星生物科技有限公司;無水乙醇 國藥集團化學試劑有限公司;福林酚、DPPH 上海源葉生物科技有限公司;七水合硫酸亞鐵 西隴化工股份有限公司;三氯乙酸 上海麥克林生化科技有限公司;無水三氯化鐵 國藥集團化學試劑有限公司;鐵氰化鉀 天津市津渴精細化工研究所;以上試劑均為分析純;其他試劑 均為國產(chǎn)分析純。

JYL-C010打漿機 九陽股份有限公司;LQ-A30002電子天平 瑞安市樂祺貿(mào)易有限公司;DHP-927電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司;L3660D低速離心機 上海知信實驗儀器有限公司;SW-CJ-2D超凈工作臺 北京天林恒泰科技有限公司;LDZX-30KB立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠;手持折光儀 上海勃基儀器儀表有限公司;UV-6100分光光度計 上海元析儀器有限公司;pH計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;SC-80全自動色差計 北京京儀康光光學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 生長曲線的繪制 菌種活化:制備MRS肉湯培養(yǎng)基,120 ℃滅菌20 min。挑取4 ℃斜面保存的菌種,接種于25 mL已滅菌的MRS肉湯培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h,進行菌種活化。

取活化后的菌懸液,按1%接種量(v/v)接種到裝有10 mL MRS肉湯培養(yǎng)基的試管中,從接種開始,每隔2 h測OD580 nm值(每次取三支試管,做平行實驗),并各取1 mL菌液,梯度稀釋,接種于MRS瓊脂平板培養(yǎng)皿中,37 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48 h(每組做三次平行實驗),采用平板計數(shù)法計算活菌數(shù)(CFU/mL)。以O(shè)D580 nm值及活菌數(shù)為縱坐標,時間為橫坐標,繪制植物乳桿菌生長曲線[15-17]。

1.2.2 黑果腺肋花楸乳酸菌發(fā)酵最優(yōu)條件的優(yōu)化

1.2.2.1 單因素實驗 將活化培養(yǎng)后的菌懸液接種于經(jīng)80 ℃,15 min巴氏滅菌的黑果腺肋花楸果汁中,以總酸含量為指標,接種量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、料液比和蔗糖添加量為影響因素進行單因素實驗。

接種量的確定:在發(fā)酵時間為20 h,發(fā)酵溫度為37 ℃,料液比為1∶1(v∶v),蔗糖添加量為7%的條件下,按不同接種量(6、7、8、9、10)lg(CFU/mL)進行黑果腺肋花楸植物乳桿菌發(fā)酵,根據(jù)總酸含量確定發(fā)酵接種量。

發(fā)酵時間的確定:在接種量為7 lg CFU/mL,發(fā)酵溫度為37 ℃,料液比為1∶1(v∶v),蔗糖添加量為7%的條件下,按不同發(fā)酵時間(14、16、18、20、22 h)進行黑果腺肋花楸植物乳桿菌發(fā)酵,根據(jù)總酸含量確定發(fā)酵時間。

發(fā)酵溫度的確定:在接種量為7 lg CFU/mL,發(fā)酵時間為20 h,料液比為1∶1(v∶v),蔗糖添加量為7%的條件下,按不同發(fā)酵溫度(31、33、35、37、39 ℃)進行黑果腺肋花楸植物乳桿菌發(fā)酵,根據(jù)總酸含量確定發(fā)酵溫度。

料液比的確定:在接種量為7 lg CFU/mL,發(fā)酵時間為20 h,發(fā)酵溫度為37 ℃,蔗糖添加量為7%的條件下,按不同料液比(3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3(v∶v))進行黑果腺肋花楸植物乳桿菌發(fā)酵,根據(jù)總酸含量確定發(fā)酵料液比。

蔗糖添加量的確定:在接種量為7 lg CFU/mL,發(fā)酵時間為20 h,發(fā)酵溫度為37 ℃,料液比為1∶1(v∶v)的條件下,按不同蔗糖添加量(0%、3%、5%、7%、9%)進行黑果腺肋花楸植物乳桿菌發(fā)酵,根據(jù)總酸含量確定蔗糖添加量。

1.2.2.2 正交試驗 根據(jù)單因素實驗的結(jié)果,選擇接種量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度和料液比為影響因素,設(shè)計L9(34)正交試驗,以總酸含量為指標,優(yōu)化最佳發(fā)酵條件。正交因素與水平見表1。

表1 正交實驗因素與水平表Table 1 Factors and levelsTable of orthogonal experiment

1.2.3 總酸含量的測定 參照國標GB/T 12456-2008。

1.2.4 pH的測定 用pH計測定。

1.2.5 可溶性固形物含量的測定 手持折光儀測定。

1.2.6 總酚含量的測定 根據(jù)Li等[18]的方法略作修改。參考王行等[19]的方法,配制濃度梯度的焦性沒食子酸溶液,準確吸取2 mL不同濃度的焦性沒食子酸與2 mL Folin-Ciocalteu試劑反應,在765 nm處測定吸光度,繪制標準曲線,得方程:y=0.0109x+0.0015,R2=0.9995。

用蒸餾水按1∶10(v∶v)將Folin-Ciocalteu試劑稀釋,吸取0.4 mL樣品與2 mL稀釋的Folin-Ciocalteu試劑于試管中,再加入7.5%的Na2CO3溶液1.8 mL,混合均勻,常溫下反應1 h,在765 nm 處測得吸光值?？偡雍恳詍L-1樣品含有量相當于μg焦性沒食子酸表示。

1.2.6 還原糖含量的測定 參照國標GB 5009.7-2016。

1.2.7 色差的測定 采用全自動色差儀對黑果腺肋花楸果汁CIE-L*a*b*值測定,得到亮度值L*、紅色色調(diào)a*、黃色色調(diào)b*,通過公式計算ΔE,ΔE=[(ΔL*)2+(Δa*)2+(Δb*)2]1/2。

1.2.8 抗氧化活性的測定 DPPH自由基清除能力的測定參照陳建國等[20]方法;OH自由基清除能力的測定參照李艷伏等[21]的方法;總還原能力的測定參照鄭義等[22]的方法。

1.2.9 感官評價 對鮮榨果汁和發(fā)酵果汁進行感官評價,將樣品隨機編號,裝在相同的一次性水杯中。選15位有經(jīng)驗的評價人組成評審小組,從色澤、香氣、口感和組織狀態(tài)對果汁進行綜合評分,對15組數(shù)據(jù)求平均值進行統(tǒng)計分析。感官評價標準見表2。

表2 花楸飲料的感官評分標準Table 2 Sensory evaluation criteria of Aronia juice

1.3 數(shù)據(jù)處理

本實驗利用Excel和IBM SPSS Statistics 21軟件,對單因素實驗數(shù)據(jù)進行處理并作圖,結(jié)果以平均值±標準差表示;利用IBM SPSS Statistics 21對正交實驗結(jié)果進行方差分析,并對結(jié)果進行顯著性分析,p<0.05為顯著性差異水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長曲線的繪制

植物乳桿菌生長變化情況如圖1所示。0～4 h植物乳桿菌處于生長適應期,培養(yǎng)液中的活菌數(shù)基本不變。4～10 h植物乳桿菌處于對數(shù)生長期,此階段,植物乳桿菌大量繁殖增長,菌體數(shù)目呈幾何倍數(shù)增加[18]。當對數(shù)生長期結(jié)束時,培養(yǎng)基中活菌數(shù)從7.5 lg CFU/mL增加到9.8 lg CFU/mL。10 h以后進入穩(wěn)定期,此階段,培養(yǎng)液中的植物乳桿菌增殖與死亡處于平衡狀態(tài),活菌數(shù)不會出現(xiàn)較大波動[18-19]。為保證后續(xù)實驗中植物乳桿菌最大接種活力,綜合考慮,選取培養(yǎng)時間為10 h的植物乳桿菌進行實驗。

圖1 植物乳桿菌C8-1生長曲線Fig.1 Growth curve of Lactobacillus plantarum C8-1

2.2 單因素實驗結(jié)果

2.2.1 接種量對植物乳桿菌發(fā)酵黑果腺肋花楸的影響 由圖2可知,隨著接種量的增加,發(fā)酵后黑果腺肋花楸果汁中總酸含量逐漸升高,接種量達到9 lg CFU/mL后,隨接種量增加,總酸含量無顯著變化(p>0.05)。可能的原因是,黑果腺肋花楸果汁中的營養(yǎng)物質(zhì)不能滿足過量植物乳桿菌生長的需要[23-24]。綜合經(jīng)濟效益,選擇接種量7、8、9 lg CFU/mL三個水平進行正交試驗。

圖2 接種量對植物乳桿菌發(fā)酵黑果 腺肋花楸果汁總酸含量的影響Fig.2 Effect of inoculation amount on total acid content of Lactobacillus plantarum fermented Aronia juice

2.2.2 發(fā)酵時間對植物乳桿菌發(fā)酵黑果腺肋花楸的影響 由圖3可知,隨發(fā)酵時間的延長,經(jīng)過發(fā)酵的黑果腺肋花楸果汁中總酸含量逐漸增多,當發(fā)酵時間達到18 h時,總酸含量達到最高,之后變化不顯著(p<0.05)。隨發(fā)酵時間的延長,黑果腺肋花楸果汁基質(zhì)中營養(yǎng)物質(zhì)逐漸被消耗,植物乳桿菌增殖生長逐漸減弱。繼續(xù)延長發(fā)酵時間,植物乳桿菌發(fā)酵效果變化不顯著(p<0.05),因此選擇發(fā)酵時間18、20、22 h三個水平進行正交試驗。

圖3 發(fā)酵時間對植物乳桿菌發(fā)酵黑果 腺肋花楸果汁總酸含量的影響Fig.3 Effect of fermentation time on total acid content of Lactobacillus plantarum fermented Aronia juice

2.2.3 發(fā)酵溫度對植物乳桿菌發(fā)酵黑果腺肋花楸的影響 由圖4可知,在一定溫度范圍(31～35 ℃)內(nèi),隨著溫度升高,菌種活力逐漸增強,產(chǎn)酸量提高;當溫度超過35 ℃,發(fā)酵后的黑果腺肋花楸果汁中產(chǎn)酸量呈現(xiàn)下降趨勢。可能的原因有:一是溫度升高,超過植物乳桿菌最適生長溫度,影響植物乳桿菌生長作用,加速菌種衰老,產(chǎn)酸量降低[25];二是發(fā)酵過程中,樣品中酒石酸被植物乳桿菌降解為乙酸和乳酸,揮發(fā)性有機酸含量增加,隨著溫度的升高,揮發(fā)性有機酸受溫度影響,導致更多的揮發(fā)散失[26]。因此選擇發(fā)酵溫度33、35、37 ℃三個水平進行正交試驗。

圖4 發(fā)酵溫度對植物乳桿菌發(fā)酵黑果 腺肋花楸果汁總酸含量的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on total acid content of Lactobacillus plantarum fermented Aronia juice

2.2.4 料液比對植物乳桿菌發(fā)酵黑果腺肋花楸的影響 由圖5可知,當液體與物料比超過1∶1(v∶v)時,隨料液比中水分含量的增加,總酸含量逐漸增多,當料液比為1∶3(v∶v)時,發(fā)酵后的黑果腺肋花楸果汁中總酸含量達到最高。考慮到發(fā)酵果汁的營養(yǎng)價值及感官品質(zhì),不進行更低料液比的實驗研究,因此選擇料液比1∶1、1∶2、1∶3(v∶v)三個水平進行正交試驗。

圖5 料液比對植物乳桿菌發(fā)酵黑果 腺肋花楸果汁總酸含量的影響Fig.5 Effect of feed/water ratio on total acid content of Lactobacillus plantarum fermented Aronia juice

2.2.5 蔗糖添加量對植物乳桿菌發(fā)酵黑果腺肋花楸的影響 由圖6可知,蔗糖添加量為0的植物乳桿菌發(fā)酵果汁中,總酸含量低,發(fā)酵效果差,可能是黑果腺肋花楸果汁中的碳水化合物不能夠滿足植物乳桿菌生長與繁殖的需求,因此導致沒有足夠的植物乳桿菌參與整個發(fā)酵。隨蔗糖添加量的增加(3%～7%),發(fā)酵后的黑果腺肋花楸果汁中總酸含量顯著增多(p<0.05),植物乳桿菌的發(fā)酵效果明顯增強。當蔗糖添加量為9%時,黑果腺肋花楸果汁中總酸含量顯著減少(p<0.05),可能是果汁中蔗糖含量過高,果汁滲透壓增大,超過植物乳桿菌對滲透壓的抵抗能力,影響植物乳桿菌正常生長[27]。

圖6 蔗糖添加量對植物乳桿菌發(fā)酵黑果 腺肋花楸果汁總酸含量的影響Fig.6 Effect of sucrose supplementation on total acid content of Lactobacillus plantarum fermented Aronia juice

2.3 正交試驗結(jié)果

正交試驗結(jié)果及極差結(jié)果見表3。由表3可知,極差RD>RA>RC>RB,植物乳桿菌發(fā)酵黑果腺肋花楸果汁總酸含量影響因素的強弱順序為:料液比>接種量>發(fā)酵時間>發(fā)酵溫度。

表3 正交實驗結(jié)果及極差分析Table 3 Results and range analysis of orthogonal experiment

表4為方差分析結(jié)果。由表4可知,因素A對實驗結(jié)果的影響極顯著(p<0.01),因素D對實驗結(jié)果的影響顯著(p<0.05)。

表4 正交試驗方差分析Table 4 Analysis of variance in orthogonal test

正交實驗分析可知,最優(yōu)組合為A3B2C3D3,即接種量9lg CFU/mL,發(fā)酵溫度35 ℃,發(fā)酵時間22 h,料液比1∶3(v∶v)。由于最優(yōu)組合不在所設(shè)計的9組實驗中,因此選擇該實驗方案進行驗證試驗。在此條件下,經(jīng)植物乳桿菌發(fā)酵黑果腺肋花楸果汁中,總酸含量6.60 mg/mL,綜合總酸含量最高。

2.4 發(fā)酵對黑果腺肋花楸果汁理化品質(zhì)的影響

表5～表6顯示了發(fā)酵對黑果腺肋花楸果汁理化性質(zhì)和色澤的影響。由表5可知,黑果腺肋花楸果汁經(jīng)發(fā)酵處理后,總酚含量增加了10.51%,可能是發(fā)酵處理過程中,大分子的酚類物質(zhì)在植物乳桿菌的作用下,分解為小分子的酚類物質(zhì)[28];同時,一些與蛋白質(zhì)和多糖結(jié)合的酚類物質(zhì)在發(fā)酵過程中被釋放出來[29]?？偹岷吭黾恿?4.60%,這是由于植物乳桿菌屬于同型發(fā)酵乳酸菌,在發(fā)酵期間,能夠大量產(chǎn)酸,同時引起pH的降低。由于植物乳桿菌的生長代謝以葡萄糖及蔗糖為碳源,導致發(fā)酵后的黑果腺肋花楸果汁中的還原糖及可溶性固形物含量減少。由表5可知,發(fā)酵后的黑果腺肋花楸果汁亮度L*值增大,紅色色調(diào)a*值增大,黃色色調(diào)b*值增大,說明發(fā)酵對黑果腺肋花楸果汁的亮度、紅色及黃色均有加強作用。其中紅色色調(diào)受花青素的影響較大,可能是發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸使得黑果腺肋花楸果汁的pH降低,花青素的紅顏色深淺同pH成負相關(guān)[29-30],進而導致紅色色調(diào)增強;黃色色調(diào)受總酚和總黃酮等酚類物質(zhì)影響較大,可能是因為植物乳桿菌發(fā)酵促進了多酚類物質(zhì)的釋放及產(chǎn)生,導致發(fā)酵后的黑果腺肋花楸果汁中的多酚類物質(zhì)增加,進而導致黃色色調(diào)增強[31-32]。

表5 發(fā)酵對黑果腺肋花楸果汁理化性質(zhì)的影響Table 5 Effects of fermentation on physico-chemical properties of Aronia

表6 發(fā)酵對黑果腺肋花楸果汁色澤的影響Table 6 Effect of fermentation on the color of Aronia juice

由表7可知,發(fā)酵處理后的黑果腺肋花楸果汁的DPPH清除率為65.13%,羥自由基清除率為63.75%,總還原能力為0.720,極顯著高于對照組果汁的52.25%、49.69%、0.372(p<0.01),發(fā)酵處理能夠顯著增強黑果腺肋花楸果汁抗氧化能力(p<0.01)?？偡雍颗c抗氧化活性呈正相關(guān),多酚類物質(zhì)含量越高,抗氧化能力越強[33],發(fā)酵處理的黑果腺肋花楸果汁中總酚含量極顯著提高(p<0.01),因此,發(fā)酵后的黑果腺肋花楸果汁的抗氧化能力極顯著高于鮮榨果汁(p<0.01)。

表7 發(fā)酵果汁與對照組的DPPH自由基清除率、 OH自由基清除率和總還原能力的比較Table 7 Comparation of OH clearance,DPPH clearance and the total reducing power of fermented juice and control

15位評價員按制定的評價指標對發(fā)酵果汁和鮮榨果汁進行感官評價,評價結(jié)果如圖7所示。由圖7可知,果汁經(jīng)過發(fā)酵處理后,香氣和口感的評分較鮮榨果汁有明顯提高,這說明發(fā)酵處理能夠有效改善黑果腺肋花楸果汁酸澀的口感和濃厚的青草味。實驗結(jié)果與文獻報道相似,眾多研究人員表明,乳酸菌發(fā)酵能夠在很大程度上改善果蔬制品和奶制品的風味及質(zhì)地[34-35]。

圖7 感官評價評定結(jié)果Fig.7 Results of the sensory evaluation

3 結(jié)論

本實驗首次利用植物乳桿菌C8-1對黑果腺肋花楸果汁進行發(fā)酵研究,對其生長周期研究可知,植物乳桿菌C8-1的生長適應期為4 h,4～10 h為對數(shù)期,10 h達到生長穩(wěn)定期。經(jīng)單因素實驗以及正交試驗對發(fā)酵條件進行優(yōu)化,得到的最佳發(fā)酵條件為:接種量9lg CFU/mL,發(fā)酵溫度35 ℃,發(fā)酵時間22 h,料液比1∶3(v∶v),在此條件下,總酸含量為6.60 mg/mL,發(fā)酵達到最佳狀態(tài),產(chǎn)品感官評分較鮮榨果汁提升明顯。果汁發(fā)酵前后品質(zhì)對比實驗表明,發(fā)酵處理對黑果腺肋花楸果汁的亮度、紅色及黃色均有加強作用;總酸含量增加了74.60%;總酚含量增加了10.51%;還原糖含量降低4.41%,可溶性固形物含量降低6.15%;發(fā)酵處理后的黑果腺肋花楸果汁的DPPH清除率為65.13%,羥自由基清除率為63.75%,總還原能力為0.720,極顯著高于對照組果汁的52.25%、49.69%、0.372(p<0.01),發(fā)酵處理能夠顯著增強黑果腺肋花楸果汁抗氧化能力(p<0.01);感官評分較鮮榨果汁有明顯提高,這說明發(fā)酵處理能夠有效改善黑果腺肋花楸果汁的口感和風味。本實驗為黑果腺肋花楸精深加工和綜合利用提供了新思路。