曾劍華,楊 楊,石彥國,辛嘉英,2,*

(1.哈爾濱商業(yè)大學(xué),食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實驗室,黑龍江哈爾濱 150076; 2.中國科學(xué)院,蘭州化學(xué)物理研究所羰基合成和選擇氧化國家重點(diǎn)實驗室,甘肅蘭州 730000)

近年來,人口的激增增加了人們對能源、食品等資源的需求,諸如石油、天然氣等不可再生資源面臨著巨大的壓力;微藻具有生長速度快、產(chǎn)量高及不占耕地等特性[1],且能緩解溫室效應(yīng)[2];在開發(fā)生物柴油能源方面具有廣闊的前景,是不可再生資源替代品;同時微藻蛋白等活性物質(zhì)作為保健品、藥品和化妝品等行業(yè)的原料來源也具有很大潛力,因此微藻成為國內(nèi)外研究熱點(diǎn)[3-4];微藻的主要功效成分包括多不飽和脂肪酸、多糖、蛋白質(zhì)等[5-8];而促進(jìn)健康作用的大多數(shù)功能組分與蛋白質(zhì)或肽相關(guān)[9];因此,具有廣譜生物學(xué)特性如抗高血壓、抗腫瘤以及治療心血管疾病的微藻生物功能蛋白質(zhì)和肽類備受關(guān)注[10-11]。

微藻細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和組成對胞內(nèi)生物分子的釋放和提取有重要影響[12-15]。例如,螺旋藻細(xì)胞壁是由肽聚糖組成,其穩(wěn)定性比細(xì)胞壁由纖維素組成的微擬球藻和二形柵藻差,微藻破壁后蛋白提取率為74%;但是二形柵藻有雙層細(xì)胞壁結(jié)構(gòu),細(xì)胞壁較堅固,其蛋白質(zhì)得率最低僅為17%[16]。可見微藻細(xì)胞輕度破碎技術(shù)的選擇與微藻細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)特征有關(guān)。目標(biāo)物質(zhì)的數(shù)量和質(zhì)量也與細(xì)胞破碎方式密切相關(guān)[15-18],為突破這一限制,首先必須采取適當(dāng)?shù)募夹g(shù)破碎細(xì)胞壁打開細(xì)胞膜,最大限度地釋放目標(biāo)物質(zhì)。

此外,細(xì)胞破碎技術(shù)的選擇除了考慮微藻復(fù)雜的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)外,很大程度上還取決于目標(biāo)物質(zhì)的功能性質(zhì)[19]。采取輕度細(xì)胞壁破碎技術(shù),從微藻中獲得可觀的蛋白質(zhì)提取率同時還能保持蛋白質(zhì)的生物活性[20];由此,基于微藻的生物煉制技術(shù)可以實現(xiàn)將生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為各種高附加值產(chǎn)品[21]。

微藻作為多種生物制品原料具有很大潛力,但其剛性細(xì)胞壁阻礙了胞內(nèi)物質(zhì)的有效釋放,至今對輕度破碎微藻細(xì)胞釋放蛋白質(zhì)等活性物質(zhì)尚無高效技術(shù),因而微藻的商業(yè)化應(yīng)用尚處于初級階段[22]。目前,國內(nèi)外多數(shù)研究致力于開發(fā)具有經(jīng)濟(jì)效益的微藻上游加工技術(shù)[23-24],微藻在生物燃料方面研究成果頗豐[25-26],而關(guān)于微藻輕度細(xì)胞破碎和生物功能蛋白質(zhì)的回收方面報道還較少[12,27]。這也是微藻深加工利用的瓶頸所在;本綜述探了微藻的輕度細(xì)胞破碎方法釋放功能性蛋白質(zhì)的最新進(jìn)展和研究方向,對傳統(tǒng)和新興的輕度細(xì)胞破碎技術(shù)進(jìn)行比對分析,提出今后可能的發(fā)展方向。

1 微藻概述

1.1 微藻的類型

微藻(microalgae)是一類單細(xì)胞生物,海洋和淡水均存在微藻,直徑通常小于1 mm;根據(jù)生長規(guī)模,藻類分為兩類:微藻類和大型藻類;根據(jù)營養(yǎng)方式可分為三類,即自養(yǎng)、異養(yǎng)和混合營養(yǎng)[19]。大多數(shù)微藻是自養(yǎng)的,在適宜的光照條件下,能利用二氧化碳和無機(jī)營養(yǎng)物質(zhì)等進(jìn)行代謝活動產(chǎn)生有機(jī)化合物,如碳水化合物、脂肪和蛋白質(zhì)等[2-3]。異養(yǎng)與自養(yǎng)相反,它們不能固定碳,因此需要提供有機(jī)碳源,例如葡萄糖等,作為生命代謝能量來源;微藻的異養(yǎng)培養(yǎng)是高附加值化合物原料的主要來源[28]。大規(guī)模培養(yǎng)用于商業(yè)化的藻類稱為商業(yè)微藻,包括四個微藻屬,綠藻門(Chlorophyta)、紅藻門(Rhodophyta)、定鞭藻門(Haptonema)和原生藻屬(Catenella)[29]。

1.2 微藻的主要成分

微藻含有蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、碳水化合物、色素、無機(jī)鹽以及維生素等成分;主要成分為蛋白質(zhì)、碳水化合物和脂質(zhì)。表1為常見食物和藻類組成成分表。據(jù)研究顯示,蛋白質(zhì)是微藻生物量的主要成分(通常為干重的40%～60%),其次是脂質(zhì)和碳水化合物。微藻具有合成所有類型氨基酸的能力,能提供人體所需的所有必需氨基酸,由此,微藻蛋白在某種程度上優(yōu)于大多動植物蛋白。微藻蛋白在保健品、藥品等行業(yè)的應(yīng)用也越來越廣泛[30]。

表1 常見食物和藻類組成成分(%,干重)Table 1 General composition of different algae and common food(%,DW)

1.3 微藻細(xì)胞壁

細(xì)胞壁是保持細(xì)胞完整性以及抵御入侵者和在惡劣環(huán)境下的主要保護(hù)屏障。結(jié)構(gòu)復(fù)雜的細(xì)胞壁通常是由多糖(如纖維素)、果膠、甘露糖、木聚糖、礦物質(zhì)(鈣、鎂或硅酸鹽)、蛋白質(zhì)(如糖蛋白)等組成,具有機(jī)械強(qiáng)度高且化學(xué)耐性強(qiáng)等特點(diǎn)[31]。藻類細(xì)胞壁的組成和結(jié)構(gòu)是復(fù)雜多變的,從微小單層細(xì)胞膜到多層復(fù)合嵌套結(jié)構(gòu);了解藻類細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)性質(zhì)對生物破碎具有重要意義,可以有針對性地選擇適宜的輕度細(xì)胞破碎技術(shù),以增大提取率和更好的保護(hù)目標(biāo)產(chǎn)物的生物活性;但是大多數(shù)微藻細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)性質(zhì)仍不是很清楚[32]。表2為4種常用微藻的細(xì)胞壁特征、主要成分及其主要用途。

表2 4種微藻細(xì)胞壁特征、成分及其主要用途[14,33]Table 2 Characteristics and components of four microalgae cell walls and their main applications[14,33]

2 微藻蛋白的功能及其應(yīng)用

微藻蛋白具有抗氧化、抗高血壓、抗腫瘤等多種功能,食品、保健品、藥品和化妝品等行業(yè)具有廣泛的應(yīng)用前景。

微藻蛋白質(zhì)在數(shù)量和質(zhì)量方面與大豆、雞蛋和魚類等常規(guī)食品蛋白相當(dāng)、甚至更好,且微藻蛋白的氨基酸含量均衡,而被認(rèn)為是蛋白質(zhì)的重要替補(bǔ)來源。目前,微藻蛋白以藻類生物質(zhì)的形式或作為提取的蛋白質(zhì)形式,已經(jīng)用于食品和飼料中。如,螺旋藻、小球藻、杜氏鹽藻等藻類蛋白作為食品添加劑已被美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)認(rèn)可[33];利用杜氏鹽藻生產(chǎn)β-類胡蘿卜素制成添加劑用于產(chǎn)蛋雞的飼料中,可以使蛋黃顏色更鮮艷[34]。

微藻蛋白用于化妝品產(chǎn)品的開發(fā)也具有很大的發(fā)展?jié)摿?目前關(guān)于螺旋藻、小球藻和杜氏鹽藻等藻類蛋白水解產(chǎn)生的類菌孢素氨基酸(MAAs)的研究顯示,(MAAs)可以減少紫外線對皮膚的傷害,表明MAAs具有一定的抗氧化作用[35-36]。

微藻蛋白不僅用于飼料、食品和化妝品行業(yè),研究表明,由于蛋白質(zhì)及其水解產(chǎn)物或濃縮物和肽產(chǎn)品能夠抑制腎素、血管緊張素、醛固酮系統(tǒng)(RAAS)內(nèi)的酶并降低血壓[37]。此外,在紫外線照射皮膚成纖維細(xì)胞試驗研究中,用小球藻蛋白衍生的肽混合物(5、10 mg/L)處理的皮膚細(xì)胞在72 h內(nèi)顯示出100%的細(xì)胞保護(hù)作用[38];小球藻蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生的五肽(Leu-Asn-Gly-Asp-Val-Trp)在體外過氧自由基和DPPH自由基清除實驗,以及猴腎細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)自由基清除活性顯示具有強(qiáng)烈自由基清除能力[39]。因此蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)水解濃縮物和肽產(chǎn)品具有抗氧化、抗高血壓等功效，其在藥品工業(yè)中的應(yīng)用也越來越多。

基于微藻活性物質(zhì)多種功能特性,微藻蛋白或?qū)⑦M(jìn)一步用于抗病毒研究如埃博拉病毒、HIV病毒的研究。已有關(guān)于微藻代謝物用于HIV病毒的研究報道。例如Deniz等[40]研究顯示,螺旋藻水提取物能抑制人T細(xì)胞系外周血單核細(xì)胞和郎格爾漢細(xì)胞中HIV-1 的復(fù)制。Matip等研究表明每日平衡膳食組合補(bǔ)充螺旋藻飲食已顯著增加了CD4細(xì)胞和6個月后 HIV病毒量顯著降低[41]。

3 微藻輕度破碎技術(shù)

微藻的生物降解受到剛性細(xì)胞壁的限制,為促進(jìn)胞內(nèi)物質(zhì)釋放,尤其是微藻生物活性物質(zhì)如蛋白質(zhì)、多不飽和脂肪酸、色素等的溶出,必須對微藻細(xì)胞壁進(jìn)行降解甚至破碎。微藻是真核細(xì)胞,其細(xì)胞壁與原核細(xì)胞不同,細(xì)胞壁韌性對機(jī)械破碎和化學(xué)破碎具有相當(dāng)大的抵抗力。加大機(jī)械或者化學(xué)破碎力度雖能促進(jìn)胞內(nèi)物質(zhì)的釋放,但是這勢必影響微藻蛋白等活性物質(zhì)的活性;同樣機(jī)械破碎力度增大會增加能耗而增加經(jīng)濟(jì)成本;由此,輕度細(xì)胞破碎技術(shù)成了關(guān)鍵,既要最大限度釋放胞內(nèi)物質(zhì)以獲得最大回收率,又要保持微藻蛋白的生物活性,還要考慮技術(shù)的擴(kuò)大及經(jīng)濟(jì)可行性。

在傳統(tǒng)細(xì)胞破碎的方法基礎(chǔ)上,基于提取胞內(nèi)活性物質(zhì)原則篩選出溫和的輕度細(xì)胞破碎技術(shù);根據(jù)細(xì)胞破碎技術(shù)發(fā)展將其分為傳統(tǒng)現(xiàn)有技術(shù)和新興潛在細(xì)胞破碎技術(shù)。從傳統(tǒng)細(xì)胞破碎技術(shù)中挑選出珠磨法、高壓勻漿技術(shù)、超聲法、離子液體和酶解法的作為代表;選擇流體空化技術(shù)、微流法、脈沖處理技術(shù)和陽離子聚合物涂抹法作為潛在的微藻細(xì)胞破碎技術(shù)代表。

3.1 現(xiàn)有溫和、輕度細(xì)胞破碎技術(shù)

3.1.1 珠磨法 珠磨法一種機(jī)械細(xì)胞破碎方法,所用設(shè)備為球磨機(jī),小球直徑通常小于1 mm;經(jīng)過攪拌器使得微藻細(xì)胞懸液與珠子之間充分混合,通過珠子與細(xì)胞之間的互相碰撞、剪切,造成細(xì)胞壁破裂促進(jìn)胞內(nèi)物質(zhì)溶出[42]。珠磨法由于細(xì)胞破碎率高、通量高以及良好的溫度控制而備受關(guān)注,且勞動力強(qiáng)度低、細(xì)胞破碎連續(xù)化程度高,易于工業(yè)化實施。市售設(shè)備最常見的設(shè)計如圖1所示。球磨機(jī)軸可以攜帶不同設(shè)計(同心或偏心盤或環(huán))的攪拌器,將動能輸出到腔室中的小鋼珠、玻璃珠或陶瓷珠[1]。

圖1 球磨機(jī)閥座示意圖Fig.1 Valve seat schematic of bead mill

細(xì)胞破碎之后,珠子可通過重力從攪拌溶液中分離。在處理熱敏產(chǎn)品時,在中斷過程中需要有效的冷卻裝置,防止蛋白質(zhì)等活性物質(zhì)變性失活。因球磨機(jī)研磨室配有冷卻裝置,其摩擦熱可以通過冷卻盤管去除,被認(rèn)為是生物煉制的有效的輕度破碎技術(shù)。

目前,珠磨法主要用于研究微藻細(xì)胞的脂質(zhì)提取,因而少有研究者關(guān)注珠磨法溫和的細(xì)胞破碎條件[20]。迄今為止,使用珠磨機(jī)溫和、輕度破碎微藻細(xì)胞壁釋放微藻蛋白等活性成分的研究已有報道[42]。Safi等[43]在微擬球藻細(xì)胞破碎能耗及水溶性蛋白溶出的研究表明,珠磨法在20 min內(nèi)細(xì)胞破碎率達(dá)到95%以上,蛋白質(zhì)提取率為53%。值得注意的是,蛋白質(zhì)釋放的一級動力學(xué)常數(shù)(k=1.2 min-1)是細(xì)胞破碎動力學(xué)常數(shù)的6倍(k=0.21 min-1),表明細(xì)胞完全破碎不是完全釋放細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的先決條件;修正一階動力學(xué)模型后的比能量輸入為0.43 kWh/kg生物量。此外Postma等[44]關(guān)于用珠磨法破碎微藻細(xì)胞壁的珠粒直徑大小研究表明,珠粒直徑減小,蛋白質(zhì)釋放率呈增大趨勢,能量呈下降趨勢;當(dāng)珠粒直徑為0.4 mm時,小球藻破碎率達(dá)97%,蛋白質(zhì)提取率最大,為57%,能耗為0.72 kWh/K WD。減小珠粒的尺寸將同時增加珠粒和細(xì)胞之間的接觸面積,因此,細(xì)胞破碎將加速且能量輸入降低。最新研究成果均比之前Postma[45]等用珠磨法得到小球藻蛋白質(zhì)提取率(30%～42%)要高。

珠磨機(jī)雖然可以實現(xiàn)高效率的細(xì)胞破碎,也能連續(xù)生產(chǎn)化;但是當(dāng)大規(guī)模應(yīng)用時,該技術(shù)將消耗大量的能量。操作參數(shù)如轉(zhuǎn)速、進(jìn)料速度、珠子直徑與用量以及參數(shù)之間的內(nèi)在聯(lián)系等也會對細(xì)胞破碎效率產(chǎn)生影響,從而影響細(xì)胞破碎過程的總體成本。

3.1.2 高壓勻漿法(HPH) HPH法已廣泛應(yīng)用于乳制品行業(yè)以減少乳化脂肪微粒的大小以及滅菌處理,因此可應(yīng)用于高濃度(20%～25%,w/w)的藻類糊劑[46]。HPH特別適用于具有剛性細(xì)胞壁的微藻細(xì)胞破碎;在高壓勻漿閥座單元中,在高壓室(150～400 MPa)細(xì)胞懸浮液被迫流過中心小孔,撞擊沖擊環(huán),被迫改變方向從出口管流出;在閥座和沖擊環(huán)的硬表面上沖擊細(xì)胞形成湍流、高壓剪切力,之后壓力突然下降使得細(xì)胞內(nèi)氣泡瞬間的釋放,同時伴隨流速下降而引起氣泡形成和崩潰的空化效應(yīng)最終導(dǎo)致了細(xì)胞的破碎[46-47]。

HPH作為一種相對簡單的微藻細(xì)胞破裂技術(shù),已經(jīng)廣泛于微藻油脂的提取。Yap[47]等關(guān)于HPH用于微藻細(xì)胞破碎工業(yè)化的評估結(jié)果表明,在60 MPa、藻漿濃度25%(w/w)、三酰甘油(TAG)含量為30%的條件下,用高壓勻漿機(jī)破碎微擬球藻,能耗與產(chǎn)出比為0.06(MJHPH/MJTAG)。Coons等[48]研究發(fā)現(xiàn)高壓勻漿技術(shù)不適合微藻細(xì)胞破碎工業(yè)化應(yīng)用。這兩個研究結(jié)論相反,差別在于Coons等研究的藻漿濃度為4%,而Benjamin等人研究的藻漿濃度為25%。Benjamin等人研究還發(fā)現(xiàn),隨著藻漿濃度(<25% w/w)的增大,能耗呈下降趨勢,這大大降低了高壓勻漿的能量需求,其研究成果也為HPH工業(yè)化提取微藻脂質(zhì)提供了有力的支持。

HPH很早就用于酵母細(xì)胞破碎和蛋白質(zhì)回收[49];HPH作為輕度破碎技術(shù)用于微藻細(xì)胞破碎以及生物活性物質(zhì)蛋白質(zhì)釋放的研究報道也越來越多。Safi[12]等對比了高壓勻漿技術(shù)以及堿處理的方法提取五種微藻蛋白,結(jié)果顯示,HPH處理后的蛋白提取率均高于堿處理,HPH處理后水溶性蛋白溶出率最大值來自紫球藻為88%,最小值來自紅球藻為40%(27%);而堿處理后對應(yīng)的蛋白溶出率分別為76%和27%;HPH處理對應(yīng)的提取率分別為51%和41%。Safi[17]等通過手動研磨、超聲處理、化學(xué)處理以及高壓勻漿這四種技術(shù)對上述五種微藻進(jìn)行細(xì)胞破碎,試驗結(jié)果同樣顯示,高壓勻漿技術(shù)擁有最高的蛋白質(zhì)溶出率,最大值來自紫球藻90%,微擬球藻則為52%,最小值來自紅球藻41%;三種微藻蛋白提取率分別為53%、25%和21%。這些結(jié)果均表明HPH是微藻細(xì)胞破碎最有效的技術(shù)。為進(jìn)一步證實高壓勻漿技是最適細(xì)胞破碎技術(shù),Safi[43]等隨后對微擬球藻細(xì)胞破碎的能耗以及水溶性蛋白釋放進(jìn)行研究,HPH細(xì)胞破碎率大于95%,蛋白質(zhì)提取率則均在50%左右;HPH比能耗低至0.32 kWh/kg WD,該結(jié)果與Yap等[47]的研究結(jié)果相一致,為高壓勻漿技術(shù)微藻細(xì)胞破碎工業(yè)化應(yīng)用提供了有力的數(shù)據(jù)支撐。

為進(jìn)一步提高HPH處理微藻細(xì)胞破碎后的蛋白溶出,可以使用組合技術(shù)手段,如將HPH和酶處理等相結(jié)合以提高水溶性蛋白質(zhì)的提取率。

3.1.3 超聲處理法 超聲波處理技術(shù)由于在處理低劑量樣品時操作簡便、損失較少,在實驗室已普遍應(yīng)用于細(xì)胞破碎處理。超聲波能用于破碎細(xì)胞壁歸功于超聲波產(chǎn)生的微尺度渦流和高效傳質(zhì),以及氣泡的生成、變大到最后的破碎形成的空化效應(yīng)。超聲波通過將微藻暴露于高強(qiáng)度的超聲波而引起細(xì)胞破裂,致使液體介質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生微小的不穩(wěn)定的空化氣泡,由于空化效應(yīng),氣泡爆炸產(chǎn)生沖擊波和能量,形成的高剪切力最終破壞剛性細(xì)胞壁并釋放胞內(nèi)物質(zhì)[50]。

超聲處理技術(shù)已被廣泛用于促進(jìn)黃酮、多糖[51-52]等生物活性物質(zhì)的溶出,且均顯示出良好的試驗結(jié)果。由此,超聲波處理技術(shù)被認(rèn)為是一種有效的細(xì)胞破碎技術(shù),進(jìn)而被嘗試應(yīng)用于微藻細(xì)胞破碎,期望可以加大胞內(nèi)物質(zhì)的溶出;然而近來的研究結(jié)果表明,單獨(dú)使用超聲處理技術(shù)效果并不是很理想。Zuhair[53]等用超聲提取微藻蛋白的結(jié)果顯示,在1000 W條件下超聲3 min,柵藻和萊茵衣藻的蛋白提取率能達(dá)到70%以上;其他藻類如微擬球藻和小球藻等效果較差,蛋白提取率在30%左右。該結(jié)果證實了,在大功率下超聲能對微藻細(xì)胞進(jìn)行破碎。

超聲處理技術(shù)一般結(jié)合其他處理技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞破碎,從而獲得更好的結(jié)果。如Ruilin-Zhang等[54]使用不同技術(shù)組合提取微藻蛋白的研究結(jié)果表明,單一使用超聲技術(shù)在超聲功率600 W,超聲6 s,間隔9 s,處理30 min,蛋白質(zhì)提取率為20%,遠(yuǎn)大于Lee等[52]對小球藻蛋白的提取率(<10%)。凍融技術(shù)和超聲處理相結(jié)合,蛋白質(zhì)提取率為23%;酶消化和超聲提取結(jié)合,蛋白提取率為30%;醇提、酶消化、超聲和均質(zhì)提取組合,蛋白質(zhì)提取率為72%。該結(jié)果遠(yuǎn)優(yōu)于Safi等[43]小球藻蛋白提取率為50%的研究結(jié)果;也是近年來小球藻蛋白提取率的最高的研究成果。不同的組合顯示了不同的蛋白質(zhì)提取率,其機(jī)制尚不清楚,還有待于進(jìn)一步研究。

3.1.4 離子液體處理法 細(xì)胞破碎可以由各種化合物如抗生素、螯合劑、離子液體、有機(jī)溶劑、次氯酸鹽、酸和堿引起。

有機(jī)溶劑萃取黃酮、多糖、色素等活性成分是常用化學(xué)方法,如Ruilin-Zhang等[54]的用在固液比為1∶10 (w/v),通過醇提、以及碳酸鈉提取24 h的研究結(jié)果顯示,醇提蛋白質(zhì)提取率為28%;結(jié)果高于機(jī)械處理所得的蛋白質(zhì)提取率。然而有機(jī)溶劑通常會使得蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)變性,因此處理過程要快,時間過長則導(dǎo)致失活。而離子液體處理蛋白質(zhì)的變性是可逆的,且其能保持相對穩(wěn)定的pH以及適宜的溫度。

離子液體是傳統(tǒng)溶劑的環(huán)保替代品,在0～140 ℃是液態(tài)的有機(jī)鹽,由大的不對稱有機(jī)陽離子和有機(jī)/無機(jī)陰離子組成。它們可以通過選擇陽離子或陰離子成分來調(diào)整特定的溶解度、電導(dǎo)率、極性和疏水性。此外,離子液體還具以下獨(dú)特性質(zhì):熔點(diǎn)低、揮發(fā)性極低、不可燃、熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性高的特點(diǎn);且能夠?qū)O性化合物溶解于非極性體系中[55]。這些特點(diǎn)使其成為常規(guī)溶劑的最佳選擇,因此可將離子液體處理法用于適度破碎微藻細(xì)胞。

Lee等[56]將離子液體緩沖液配合超聲處理破碎小球藻細(xì)胞提取和回收蛋白質(zhì)結(jié)果顯示,在單獨(dú)使用3-(N-嗎啉)丙磺酸膽堿-鹽酸等離子液體緩沖液時,蛋白質(zhì)回收率均低于10%;上清液的紫外譜圖在650 nm處有吸收峰,表明離子液體緩沖液對蛋白質(zhì)并不是高度選擇轉(zhuǎn)一性,葉綠素在其中起到主要的干擾作用。而當(dāng)3-(N-嗎啉)丙磺酸膽堿-鹽酸等離子液體緩沖液與超聲處理配合使用時,設(shè)定參數(shù)離子液體濃度為50 mmol/L、超聲時間為30 s、超聲功率為400 W以及藻漿濃度為6 g/L,蛋白質(zhì)提取率為25.3% WD,蛋白質(zhì)回收率達(dá)到95%。實驗結(jié)果較好,所用的試劑相對于傳統(tǒng)離子液體而言較便宜,且屬于可再生資源;有研究表明,回收的離子液體還再次用于細(xì)胞破碎,效果與新配制的離子液體等同[57],而且其能力不會隨著使用次數(shù)的加大而減少,這無異于給下游加工技術(shù)節(jié)約成本打開了一條新道路。但是如何回收3-(N-嗎啉)丙磺酸膽堿-鹽酸等離子液體也將成為一個問題。

3.1.5 酶處理法 酶由于處理條件溫和、選擇性高,同時也易于擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模,很早就被用于細(xì)胞破碎研究;但是酶處理成本相對較高,也不易于選擇轉(zhuǎn)一性很高的單一酶處理某一種微藻,這給微藻細(xì)胞破碎帶來了一定的困難。

酶處理由于具有溫和的技術(shù)條件以及良好的產(chǎn)出效果,被用于微藻細(xì)胞破碎及其蛋白質(zhì)回收應(yīng)用。Ruilin-Zhang等[54]用單一的纖維素酶處理小球藻提取蛋白質(zhì),結(jié)果顯示,蛋白質(zhì)提取率僅為17%,其效果低于溶劑以及超聲提取。為進(jìn)一步提高蛋白質(zhì)提取率,將酶處理與機(jī)械處理技術(shù)相結(jié)合,得到酶處理與超聲處理組合的結(jié)果最高,蛋白質(zhì)提取率為30%;繼續(xù)優(yōu)化并增加組合得出,酶處理結(jié)合60%乙醇浸泡、超聲和均質(zhì)處理時,蛋白質(zhì)提取率達(dá)到最大值72%。

而Zuhair[53]等用溶菌酶和纖維素酶處理各種微藻提取蛋白質(zhì),研究結(jié)果顯示,溶菌酶處理16 h后的四種微藻蛋白質(zhì)的回收率在79%～97%之間;顯示出更高的產(chǎn)率,這可能是由于溶菌酶和纖維素酶的專一性水解微藻引起的。Sierra等[27]用酶處理萊茵衣藻提取蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的最新研究結(jié)果顯示,通過自溶酶處理的蛋白質(zhì)提取率為95%;單一自溶酶處理效果優(yōu)于超聲處理。該研究為克服酶的高成本,利用原位酶生產(chǎn)自溶酶,不但降低成本,而且專一性高。這為酶處理的選擇性提供了一條新思路。

在考慮酶處理成本問題上,除了利用原位酶生產(chǎn)具有高度專一性的酶外,還可以使用固定化酶,降低所需酶的量,并且減少下游過程成本。然而,影響酶處理微藻破碎效率的缺點(diǎn)之一是處理時間長,因此與機(jī)械或化學(xué)處理相比,生產(chǎn)能力較低。

3.2 溫和、輕度細(xì)胞破碎新技術(shù)

由于微藻經(jīng)濟(jì)利用價值越來越顯著,綜合開發(fā)利用微藻胞內(nèi)所有物質(zhì)已成為趨勢。近幾十年來研究表明,現(xiàn)有的技術(shù)方法不足以滿足或不適宜全面開發(fā)利用微藻的需求;因此尋求與開發(fā)新溫和有效的微藻細(xì)胞破碎技術(shù)成為當(dāng)前提取微藻生物活性物質(zhì)的關(guān)鍵。目前已有一些新技術(shù)用于微藻細(xì)胞破碎,包括超臨界流體法、微流法、脈沖處理技術(shù)和陽離子聚合物涂層膜破碎細(xì)胞。

3.2.1 流體空化法 超臨界流體是指物質(zhì)在高于臨界溫度和臨界壓力時形成的兼具氣液兩相性質(zhì)的流體,因而具有良好的溶解特性以及擴(kuò)散性。超臨界流體技術(shù)被廣泛地用于中藥和天然產(chǎn)物活性物質(zhì)的萃取[58]。傳統(tǒng)的細(xì)胞破碎技術(shù)如高壓勻漿技術(shù)、球磨法、超聲處理等會在操作過程中產(chǎn)生大量能量或出現(xiàn)局部過熱現(xiàn)象,這對提取生物活性物質(zhì)是不利的;酶法處理則不可避免地引入雜質(zhì),增加了分離的工作量,而導(dǎo)致成本增加。而超臨界流體細(xì)胞破碎技術(shù)則很好地避免了上述問題。超臨界流體常用的有CO2、N2等;超臨界流體破碎細(xì)胞是將高壓CO2滲透到細(xì)胞內(nèi),突然降壓使細(xì)胞內(nèi)外壓差急劇增大而膨脹破裂;對于細(xì)胞壁較厚的微生物,因CO2能破壞胞壁上的脂溶性成分,破碎后的細(xì)胞碎片較大,便于下游分離;同時在降壓過程中流體體積膨脹、溫度降低,可防止因升溫引起生物活性物質(zhì)失活。

Duarte等[59]用不同破碎技術(shù)提取酵母脂質(zhì)的研究結(jié)果表明,超聲輔助CO2超臨界流體萃取酵母脂質(zhì)的提取率為20%;但比Milanesio[60]單用超臨界流體萃取酵母得到脂質(zhì)提取率為10%的高。超臨界流體細(xì)胞破碎技術(shù)與傳統(tǒng)技術(shù)如有機(jī)溶劑萃取、機(jī)械破碎等方法相比提取率雖小,但是與傳統(tǒng)技術(shù)手段相比還是存在一定的優(yōu)勢,如何進(jìn)一步探索出更有效的超臨界流體細(xì)胞破碎技術(shù)組合將是下一步研究的內(nèi)容[61]。如Dierkes等[62]進(jìn)行的一項實驗中,超臨界CO2流體能夠有效地破壞淋球菌,使細(xì)胞內(nèi)容物的釋放。得到脂質(zhì)和蝦青素的產(chǎn)率在分別在72.3%～92.6%和80%～100%之間。如此高效的破碎能力將使得超臨界流體作為適用于溫和的細(xì)胞破碎技術(shù)具有極大的潛能。

3.2.2 微流化處理法 微流化處理法用于破碎微藻細(xì)胞是最近興起的細(xì)胞破碎技術(shù),微流化均質(zhì)操作原理與高壓均質(zhì)不同[45];在微流化器中,兩股細(xì)胞懸浮液高速撞擊在固定表面,沖擊時能量瞬間消散而導(dǎo)致細(xì)胞破裂;細(xì)胞破碎的率取決于初始細(xì)胞濃度、通過的次數(shù)和壓力。因破碎室區(qū)域溫度最高,細(xì)胞懸浮液在破碎室中停留只有25～40 s;將破碎細(xì)胞液浸入冰水浴中,可防止活性物質(zhì)失活。

Cha等[63]用微流化處理小球藻提取葉黃素的研究結(jié)果顯示,微流化處理提高了小球藻在消化過程中葉黃素膠束化效率,經(jīng)68.96 MPa微流化處理后,電鏡結(jié)果顯示,小球藻粒徑由3.56 μm下降到0.35 μm。經(jīng)137.9 MPa微流化處理后,葉黃素膠束化效率提高三倍,且葉黃素穩(wěn)定性不受微流化影響。結(jié)果顯示,微流化處理法能極其有效地破碎小球藻,有效地提高了葉黃素的提取率。Cha[64]等在模擬微流化對小球藻類胡蘿卜素的生物消化過程影響實驗證實了其前期試驗結(jié)果;在137.9 MPa微流化處理后微藻平均粒徑從2463 nm下降至361 nm;玉米黃素和類胡蘿卜素模擬消化率由原來未經(jīng)處理的2.60%和1.69%分別提高到32.60%和18.19%。

這些結(jié)果均表明,微流化可有效地破碎小球藻細(xì)胞壁和提高玉米黃素和β-胡蘿卜素等生活性物質(zhì)的提取率。如Xia N等[65]通過酶輔助微流化制備大米蛋白,蛋白回收率高達(dá)81.87%,主要為谷蛋白且具有天然結(jié)構(gòu);這些結(jié)果表明,酶輔助微流化可能是非破壞性和選擇性提取水稻谷蛋白的有效技術(shù)。這也為微流化處理微藻提取活性蛋白提供借鑒。

3.2.3 脈沖電場處理法 脈沖電場用于微藻細(xì)胞破碎的研究還在起步階段;脈沖電場(PEF)或高強(qiáng)度電場脈沖(HELP)使用外部電場引起細(xì)胞膜或壁上的電場強(qiáng)度達(dá)到一定閾值后,電場誘導(dǎo)的張力誘導(dǎo)膜或細(xì)胞壁形成電穿孔,細(xì)胞的通透性增加,使胞內(nèi)物質(zhì)更容易釋放出來[65]。電穿孔的大小和數(shù)量與電場強(qiáng)度和脈沖直接相關(guān);且電穿孔的形成是不可逆的。PEF不僅破壞細(xì)胞壁,而且還影響細(xì)胞內(nèi)的分子;如PEF處理過程溫度升高而影響酶的活性,導(dǎo)致蛋白質(zhì)等高價值物質(zhì)消化率降低,從而提高脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等物質(zhì)的產(chǎn)率[1]。

張若兵等[66]用高壓脈沖電場破碎小球藻的研究表明,高壓脈沖電場強(qiáng)度和脈沖注入能量密度是影響高壓脈沖電場處理效果的關(guān)鍵因素,而脈沖寬度、脈沖重復(fù)頻率、電場極性對小球藻的處理效果影響不大。這與Lam等[67]研究脈沖電場處理效果的關(guān)鍵參數(shù)分析具有類似性。張若兵等人測試電場強(qiáng)度從2.5 MV/m增加到5.0 MV/m時,小球藻細(xì)胞破碎率從17.21%增加至83.29%;同樣增加能量的輸入細(xì)胞破碎率也增大到80%以上,細(xì)胞內(nèi)葉綠素的質(zhì)量濃度明顯下降(未給定值),顯示出脈沖電場處理有良好的的效果。但Lam等人用脈沖電場處理小球藻獲取蛋白質(zhì)的研究表明,即時輸入高能量(珠磨法的100倍[42]),蛋白質(zhì)提取率只有13%,遠(yuǎn)小于珠磨法的53%蛋白提取率,認(rèn)為PEF處理微藻細(xì)胞無法釋放足夠量的蛋白質(zhì),而且PEF耗能大。Lam[68]等又進(jìn)一步研究PEF微藻細(xì)胞破碎的處理能力,發(fā)現(xiàn)萊茵衣藻細(xì)胞壁突變體用PEF處理后水溶性蛋白質(zhì)全部溶出,蛋白質(zhì)最大提取率為37%,其效果與機(jī)械處理類似;而用PEF處理野生型萊茵衣藻蛋白提取率僅有11%左右。該實驗的微藻處理后的電鏡結(jié)果顯示突變體用PEF處理前后細(xì)胞基本保持完整性;這證明PEF是一種較溫和的細(xì)胞破碎技術(shù);但是用PEF處理的提取率偏低,還有待于進(jìn)一步研究,如結(jié)合酶處理先破碎細(xì)胞壁再進(jìn)行PEF處理,或許能達(dá)到更好的提取效果。。

3.2.4 陽離子聚合物涂膜法 目前已有提出用陽離子聚合物破碎微藻細(xì)胞[1]，如Yoo等[69]首先使用用陽離子聚合物的功能膜設(shè)計出一種新穎、輕度且高效的細(xì)胞破碎技術(shù),從濕微藻中直接提取細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)。使用涂有帶正電荷的叔胺聚合物的膜,來誘導(dǎo)具有兩性的微藻細(xì)胞膜局部靜電平衡與帶負(fù)電荷的磷脂雙層的擾動,透鏡顯示微藻的磷脂雙分子層局部重排而引起的細(xì)胞破裂,微藻破碎率在25%左右。Zhengyi等[70]用熱聚合物如聚-(N-異丙基丙烯酰胺-共-烯丙胺)和酶與微藻細(xì)胞懸浮液混合,細(xì)胞破碎率從22%增加至68%;脂質(zhì)產(chǎn)率達(dá)到了59%。該研究還發(fā)現(xiàn)該聚合物可以協(xié)助酶破碎細(xì)胞壁或者能對酶起到保護(hù)作用,證實這種簡單的先進(jìn)技術(shù)能有效地促進(jìn)了微藻細(xì)胞壁內(nèi)含物的釋放。

使用熱聚合物的優(yōu)點(diǎn)是在產(chǎn)品回收后,聚合物能進(jìn)行簡單有效的分離,還可重新使用,從而降低總成本。以上研究表明聚合物破碎微藻細(xì)胞壁提取蛋白將是一個很有前景的技術(shù)。

3.3 各種細(xì)胞破碎技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)與局限性

表3歸納了目前采用的各種微藻細(xì)胞破碎方法的優(yōu)點(diǎn)和局限性,各技術(shù)方法的比較詳見表3。

表3 各種細(xì)胞破碎技術(shù)之間的比較Table 3 Comparison of various cell disruption techniques

4 展望

微藻生物煉制的關(guān)鍵瓶頸是微藻細(xì)胞破碎,如何低成本、大規(guī)模、高效地提取微藻胞內(nèi)活性物質(zhì)(如蛋白質(zhì)等)將是未來研究的關(guān)鍵?，F(xiàn)有研究表明,細(xì)胞破碎技術(shù)之間的組合能有效提高蛋白質(zhì)產(chǎn)率,如何將具有高細(xì)胞破碎率潛力的聚合物涂抹法和其他傳統(tǒng)技術(shù)組合以提高細(xì)胞破碎率、蛋白質(zhì)產(chǎn)率和降低成本,將是未來微藻細(xì)胞破碎的發(fā)展方向。未來的微藻細(xì)胞破碎應(yīng)當(dāng)基于目標(biāo)產(chǎn)物特性,從細(xì)胞破壁原理出發(fā)采用組合破壁技術(shù)進(jìn)行破壁提取活性蛋白;如珠磨法和酶法聯(lián)合使用,先通過適度機(jī)械力破除酶作用位點(diǎn)障礙,在進(jìn)行酶解提取,從而提高蛋白的產(chǎn)量和品質(zhì)等。降低成本可從上游技術(shù)著眼:有研究顯示用PEF處理萊茵衣藻細(xì)胞壁的突變體導(dǎo)致更高的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)提取率;因此通過PEF誘導(dǎo)培養(yǎng)微藻細(xì)胞壁突變體,增大高附加值物質(zhì)產(chǎn)量的同時減少能耗。在微藻培養(yǎng)過程中,通過控制微藻和細(xì)菌協(xié)同培養(yǎng)的相互作用,細(xì)菌能有效地提高微藻蛋白等高附加值活性物質(zhì)的產(chǎn)率[71],其效果比在微藻培養(yǎng)過程中增設(shè)生物反應(yīng)器還要顯著;微藻與細(xì)菌的共生培養(yǎng)將是提高微藻生物產(chǎn)出的新方向。

權(quán)威·核心·領(lǐng)先·實用·全面